発生工学技術から展開するネコ胚性幹(ES)細胞株の樹立

2010 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21780289
• 研究機関: 大阪府立大学
• 研究代表者: 鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 助教 (40453138)
• キーワード: ネコ / 体外受精 / 体外培養 / ES細胞 / LIF

研究概要

ネコ体外受精の効率をさらに上昇させるために、ヒトで用いられている培地を用いた培養法のうち、胚の発育に必要な成分を全て含んだ培地で培養する方法(one-step法)および胚の各発生段階に適した成分を含む培地で順次培養する方法(two-step法)によって、未成熟卵子から桑実胚および胚盤胞期胚への発生率について比較した。すなわち、避妊手術で得たネコ卵巣から未成熟卵子を回収し、卵丘細胞が付着しているGrade1,2と卵丘細胞があまり付着していないGraae3の2つに分類した。それぞれの卵子をM199培地で30時間体外成熟し、HTF培地に移して18時間体外受精を行った。その後の体外培養では、(1)0.3%BSA含有Only-one培地で6日間(one-step群)(2)0.3%BSA含有Only-one培地で2日間、5%FBS含有Only-one培地で4日間(one-step+FBS群)(3)0.3%BSA含有Early-Culture培地で2日間、0.3%BSA含有Blastocyst培地で4日間(two-step群)(4)0.3%BSA含有Early-Culture培地で2日間、5%FBS含有Blastocyst培地で4日間(two-step+FBS群)の4群に分けて培養した。その結果、すべての群で胚盤胞期胚への発生が認められ、特にone-step+FBS群において、胚盤胞期胚の発生率が有意に増加した。次に、胚盤胞期胚から内部細胞塊(ICM)を分離し、ES細胞様コロニーの作製について検討したところ、細胞間境界が明瞭で、核に対して細胞質が少なく核小体が明瞭な.ヒトES細胞に類似した形態を示すコロニーが観察された。さらに、ネコES細胞の培養に必要なサイトカインであるネコLIFのクローニングを試みた。すなわち、ネコ胎子線維芽細胞からcDNAを作成し、ヒト、マウスなどで相同性が高い部分で作成したプライマーを用いてPCRによりネコLIFDNAを増幅した。増幅したDNAをシークエンスしネコLIFのアミノ酸配列を確認した。以上の結果から、ネコ体外受精系の確立に成功し胚盤胞期胚を多数供給した後、ネコES様細胞を培養することが可能となった。これらの結果は、ネコES細胞株樹立につながる研究成果である。

研究成果

• [雑誌論文] Comparison of testosterone and insulin-like peptide 3 secretions in response to human chorionic gonadotropin in cultured interstitial cells from scrotal and retained testes in dogs. (2011)
  • 著者名/発表者名: Pathirana IN, Ashida Y, Kawate N, Tanaka K, Tsuji M, Takahashi M, Hatoya S, Inaba T, Tamada H.
  • 雑誌名: Anim Reprod Sci. 巻: 124(1-2) ページ: 138-144
  • 査読あり
• [雑誌論文] Successful Management with CHOP for Pulmonary Lymphomatoid Granulomatosis in a Dog. (2011)
  • 著者名/発表者名: Hatoya S, Kumagai D, Takeda S, Yamamoto E, Nakanishi M, Kuwamura M, Sugiura K, Sasai H, Yamate J, Inaba T.
  • 雑誌名: J Vet Med Sci. 巻: 73(4) ページ: 527-530
  • 査読あり
• [雑誌論文] IFN{gamma} markedly cooperates with intratumoral dendritic cell vaccine in dog tumor models. (2010)
  • 著者名/発表者名: Mito K, Sugiura K, Ueda K, Hori T, Akazawa T, Yamate J, Nakagawa H, Hatoya S, Inaba M, Inoue N, Ikehara S, Inaba T.
  • 雑誌名: Cancer Res. 巻: 70(18) ページ: 7093-7101
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of IL-12 on canine dendritic cell maturation following differentiation induced by granulocyte-macrophage CSF and IL-4. (2010)
  • 著者名/発表者名: Sugiura K, Wijewardana V, Fujimoto M, Akazawa T, Yahata M, Mito K, Hatoya S, Inoue N, Inaba T.
  • 雑誌名: Vet Immunol Immunopathol. 巻: 137(3-4) ページ: 322-326
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of relaxin mRNA in the corpus luteum, uterus, and uterine cervix in the bitch. (2010)
  • 著者名/発表者名: Tamada H, Kawate N, Kawata N, Inaba T, Kida K, Hatoya S, Akune A, Nakama K, Kohsaka T, Sawada T.
  • 雑誌名: J Vet Med Sci. 巻: 72(10) ページ: 1383-1386
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of single nucleotide polymorphisms in the 3' region of the estrogen receptor 1 gene in normal and cryptorchid Miniature Dachshunds and Chihuahuas. (2010)
  • 著者名/発表者名: Pathirana IN, Tanaka K, Kawate N, Tsuji M, Kida K, Hatoya S, Inaba T, Tamada H.
  • 雑誌名: J Reprod Dev. 巻: 56(4) ページ: 405-410
  • 査読あり
• [雑誌論文] Locomotor improvement after autologous bone marrow stromal cell intrathecal delivery in dogs with chronic spinal cord injury.
  • 著者名/発表者名: Nishida H, Nakayama M, Tanaka H, Kitamura M, Hatoya S, Sugiura K, Suzuki Y, Ide C, Inaba T.
  • 雑誌名: Am J Vet Res 巻: (accepted)
  • 査読あり
• [学会発表] サルES細胞からのオリゴデンドロサイトへの簡便な分化誘導法 (2010)
  • 著者名/発表者名: 瀧野麻衣亜、奥野剛、鳩谷晋吾、大村雅、鳥居隆三、杉浦喜久弥、玉田尋通、川手憲俊、高橋正弘、稲葉俊夫
  • 学会等名: 日本獣医学会第150回大会
  • 発表場所: 帯広
  • 年月日: 2010-09-17
• [学会発表] FSHおよびLHによるイヌ卵子の体外成熟率の改善 (2010)
  • 著者名/発表者名: 永見俊典、鳩谷晋吾、鳥居隆三、杉浦喜久弥、大村雅、川手憲俊、玉田尋通、高橋正弘、稲葉俊夫
  • 学会等名: 日本獣医学会第150回大会
  • 発表場所: 帯広
  • 年月日: 2010-09-16
• [学会発表] 再生医療とは?基礎から動物のES・iPS細胞研究まで (2010)
  • 著者名/発表者名: 鳩谷晋吾
  • 学会等名: 日本小動物獣医師会2010年次学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2010-08-28