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初年度において、申請者らが開発したRNAポリメラーゼIIプロモーター(CMVプロモーター)により標的分子のsiRNA配列を含んだmiRNAを発現するVSV-Gレンチウイルスベクターが、培養細胞に発現させたルシフェラーゼ発現量を低下させることを確認した。そこで、造血幹細胞においても機能可能なユビキチンプロモーターにて標的分子のsiRNA配列を含んだmiRNAを発現するレンチウイルスベクターを作製した。その結果、CMVプロモーターよりも転写効率の低いユビキチンプロモーターではノックダウン効果がほとんど現れないことが明らかとなった。組織特異的プロモーターの転写効率はユビキチンプロモーターよりもさらに低いことが予想され、申請者らが開発したsiRNA配列を含んだmiRNA発現カセットでは、目的分子を効率的にノックダウンすることは難しいと判断した。そこで、siRNAを組み込むRNAをmiRNAからアデノウイルス由来のスモールRNAに変更したところ、RNAポリメラーゼIIIプロモーター(H1プロモーター)では、効率的に内在性蛋白質のノックダウンが可能であった。そこで本年度においては、初年度に開発したアデノウイルス由来のスモールRNAにsiRNA配列を組み込んだsiRNA発現カセットを、RNAポリメラーゼIIプロモーター(ユビキチンプロモーター)にてドライブするレンチウイルスベクターを開発する。さらに、内在性蛋白質の発現量を指標に、培養細胞でのノックダウン効果を評価する。レンチウイルスベクターによる標的蛋白質のノックダウン効果が確認された後、組織特異的プロモーターを用いた検討を行う。さらに、マウスin vivo実験を行うことで、動物個体での機能評価を行う。
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