| 研究概要 |
本研究では、GPCRへのリガンド結合による3量体Gタンパク質活性化を、各種RGSとGタンパク質の相互作用により検出することを目的としている。とくに生きた細胞において、活性化された三量体Gタンパク質およびRGS相互作用をFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)により検出し、生理的なGPCRシグナル伝達の時間的・空間的な解析を目指している。FRETプローブとして、蛍光色素結合Gαi1サブユニットと蛍光タンパク質を融合したRGSドメインをリンカーペプチドにより一分子化したものを作成した。5種類のRGS(RGS2,RGS4,RGS9,RGS10,GAIP)とGiクラスGタンパク質との相互作用について検討し、RGS10を用いたFRETプローブにおいて、Gタンパク質をAlF_4^-で直接活性化した場合に最も大きいFRETシグナルの増強を確認した。Gi共役型受容体受容体であるBLT1あるいはα2Aを発現させた培養細胞においてリガンド結合依存的なFRETシグナル増強の検出に成功した。Gタンパク質の定常的活性化型変異(Gαi1 Q204L mutant相当)およびRGS非相互作用変異(Gαi1 G183S mutant相当)の各改変体を用いたFRETプローブ場合、あるいはGPCRのアンタゴニストによる前処理を行った場合はFRETシグナルの変化を示さず、GPCRを介したシグナルであることが確認できた。さらに局所的なGタンパク質活性化を観察するため、分化させたヒト白血球由来HL-60細胞へFRETプローブを発現させ、細胞遊走時のFRETシグナル変化について測定を行った。マイクロピペットによるリガンド拡散刺激に対して、HL-60細胞内のFRETプローブは刺激方向へのFRETシグナル増強を示した。さらに遊走時における仮足の伸張とFRETシグナルの経時的変化ついて検討を進めている。
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