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本課題では、GPCRへのリガンド結合によるGタンパク質の活性化を直接観察するFRETプローブの開発、および生細胞でのリアルタイムイメージングによるシグナル伝達の時間的・空間的なGタンパク質活性変化の解析を目的としている。22年度は、GiクラスGタンパク質の活性変化について、生化学測定およびリアルタイムイメージングによる解析を進めた。FRETプローブを発現した培養細胞の膜画分は、野生型Gタンパク質を発現させた場合と同程度のリガンド濃度依存的GTPγS結合活性を示した。またFRETプローブを発現させた場合におけるGPCRのリガンド結合について、野生型Gタンパク質を発現させた場合と同程度の高親和性リガンド結合活性を確認した。FRETプローブを構成するGタンパク質部分は野生型と同様の活性を持つことが明らかとなった。さらに生細胞での局所的シグナル伝達と細胞走化性について測定を行った。ヒト白血球由来HL-60細胞は好中球様に分化することにより、LTB_4に対する走化性を示す。マイクロピペットを用いて溶液中にリガンド濃度勾配を作成し、FRETブローブを発現させた分化型HL-60細胞の応答について画像測定および解析を行った。FRETプローブを発現させたHL-60細胞はリガンド濃度勾配に従った走化性を示すとともに、局所的刺激に応じたFRETシグナルを示した。走化方向における細胞膜の伸長速度とFRETシグナルの強度について相関係数を求めた場合、相関係数のピークは相対時刻0より20秒程度正にあることが確認できた。細胞外の局所的リガンド刺激に応じたGPCRを介する3量体Gタンパク質の活性化部位およびこれに続く細胞の形態変化について、開発したFRETプローブにより解析可能であることが明らかとなった。
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