|
Notch受容体の上皮成長因子(EGF)ドメイン上には、特異的なO-結合型糖鎖が存在しており、機能的に重要な役割を果たしている。前年度までの研究で、新規の0-結合型糖鎖修飾として、O-N-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)修飾をショウジョウバエS2培養細胞において同定することに成功し、新規O-GlcNAc転移酵素(EOGT)がその修飾に関与する可能性を示唆するデータを得ていた。そこで、本年度は、EOGTを、S2培養細胞に遺伝子導入後、膜画分を調製し、in vitroのO-GlcNAc転移アッセイを行なった。その結果、フォールディングを受けたEGFドメイン特異的なO-GlcNAc転移活性の確認が検出できた。また、EOGTの酵素活性には2価カチオンを要求することが明らかになった。さらに、ショウジョウバエのEOGTのアミノ酸配列を元にして、マウスやヒトなどの哺乳動物ホモログを同定し、マウスEOGTの酵素活性の検出することに成功した。さらに、マウスEOGTは、ショウジョウバエEOGTとほぼ同様な酵素活性を示すことを明らかにした。さらに、細胞内のO-GlcNAc修飾に関わる糖転移酵素であるOGTのRNAiによる発現抑制の結果、細胞外O-GlcNAc修飾は、OGT非依存的に起きることが明らかになった。また、OFUT1、Rumi、FringeのRNAiによる発現抑制の結果、これらのEGFドメイン特異的に作用する糖転移酵素も、細胞外O-GlcNAc修飾には関与しないことが明らかになった。以上の結果より、細胞外のO-GlcNAc修飾はEOGT依存的な新たな修飾機構に依存すること、そして、EOGTのO-GlcNAc転移酵素活性はショウジョウバエから哺乳動物まで、進化的に保存されていることが明らかになった。
|
