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本研究では細胞1個レベルでの診断法として、がん特異抗体による蛍光免疫染色と、核の性状や細胞質の蛍光強度などのデータを自動で撮像、解析するオートスキャン式蛍光顕微鏡を併用することによる、自動細胞診の可能性を検討している。対象となる剥離がん細胞を便から分離するためには、イムノビーズが必要であるが、市販されているDynabeadsでは自家蛍光が強く、蛍光免疫染色を用いた自動細胞診には不向きであった。一方で、我々が開発した粒子径が3.0μmでEpCAM抗体を直接結合したビーズは自家蛍光もなく有用であることが分かった。また、すでに作製している抗ヒトEpCAMマウスモノクローナル抗体を結合したイムノビーズは、がん特異抗体(マウス抗体)での診断に悪影響を及ぼすために、自動細胞診には不向きであることも分かった。そのため、平成22年度は細胞回収用ビーズに適したEpCAM抗体(ラット抗体)の作製を中心に行った。ラットにEpCAM抗原を感作させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。希釈法にて単クローン化を行い、一次検定にてEpCAMに反応を示すラット抗体を8種類選定した。それぞれのハイブリドーマ上清について、EpCAM抗原を用いたELISA、EpCAM陽性細胞と陰性細胞を用いたFlow cytometry(FCM)および免疫染色を行い、ELISAで陽性、FCMおよび免疫染色ではEpCAM陽性細胞のみ陽性となり陰性細胞では陰性となる2種類の抗ヒトEpCAMラットモノクローナル抗体を樹立した。今後は、この2種類の抗体を3.0μmのビーズに結合させ、細胞の回収率および自動細胞診に悪影響を与えないかの検討を行う。
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