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ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いた破骨細胞形成系の確立およびRA自己抗原の発現
1 Ficoll-Paqueを用いて健常人協力者よりPBMCを回収し、マグネットビーズと抗ヒトCD14モノクローナル抗体を用いてCD14(+)細胞を分離し、10%FBS・M-CSF(25ng/ml)・ODF(20ng/ml)入りαMEMで培養した。3日おきにメディウムチェンジを行い、12日目、15日目には多核巨細胞を回収した。
2 回収した多核巨細胞がTRAP (Tartrate-resistant Acid Phosphatase)染色陽性であることを確認。
また、成熟破骨細胞の機能を有するか否かを確認するため、dentin sliceを用いてpit formationを確認した。TRAP染色、RANK (receptor activator of NFkappaB)、osteoprotegerin、Cathepsin Kの発現について定量RT-PCRで確認した。
3 上記、ヒトPBMCからの成熟破骨細胞形成系において、カルパイン・カルパスタチン系の細胞内分布を確認したところ、成熟過程においてカルパスタチン蛋白量が変化することが確認されたが、カルパインのmRNA量は成熟過程で変化が確認されなかった。
4 また、成熟破骨細胞におけるcalpain活性はRANKL濃度依存性に増加することが確認された。
5 なお、TNFα存在下での、成熟破骨細胞におけるcalpain活性は変化が確認されなかった。
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