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XLAの遺伝子治療を目的に、BTK遺伝子のエクソン6から19とその隣接遺伝子TIMM8Aを含むゲノム領域、およびEGFPとHygromycin (Hyg)耐性遺伝子を推載したHD-Ad.AAV.ベクターを作製し、造血幹細胞系でのBTK遺伝子修復研究を行った。
ヒト男性preB-ALL細胞株であるNalm6では0.073%で相同組換えを証明した。正常ヒト男性臍帯血より磁気ビーズを用いてCD34陽性造血幹細胞を分離し、ヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを感染させた。メチルセルロース培地へサイトカイン、ハイグロマイシンを添加しコロニーアッセイ法による培養を行った。3週間の培養によりハイグロマイシン耐性コロニーを得た。播種細胞数に対し3.6×10^<-5>の頻度でベクター搭載遺伝子の組込みをPCRにより確認し、このうち0.7%でBTK遺伝子のターゲティングを認めた。
In vitroでのB細胞分化能を評価するため、フィーダー細胞を用いずばCD34陽性造血幹細胞よりIgM陽性未熟B細胞まで分化する培養系を確立した。ヘルパー依存型アデノ.AAV.BTKベクターを感染させた正常ヒト男性臍帯血由来CD34陽性造血幹細胞を本培養系で培養し、ハイグロマイシンによる薬剤選択を行った。5週間の培養後、ハイグロマイシン耐性CD19陽性B細胞でBTK遺伝子へのターゲティングを認め、相同組換えCD34陽性細胞が造血前駆細胞のみならず、B細胞系への分化能を持つことを証明した。
コロニーアッセイ法で得られた遺伝子導入造血前駆細胞コロニーでの、LAM-PCRによる遺伝子挿入部位の検討では、遺伝子内外ともに挿入が認められたが、exon内への遺伝子挿入は認めなかった。複数のコロニーで同一部位への挿入が認められ、遺伝子導入は非ランダムであると考えられた。
コロニーアッセイ法で得られた遺伝子導入造血前駆細胞コロニーでの、LAM-PCRによる遺伝子挿入部位の検討では、遺伝子内外ともに挿入が認められたが、exon内への遺伝子挿入は認めな⇒めた。複数のコロニーで同一部位への挿入が認あられ、遺伝子導入は非ランダムであると考えられた。
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