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1.新規構成分子の同定
独自に作製したN末端配列認識抗dystrophin抗体によって、C末端を欠く低分子量dystrophinのアイソフォームが初めてタンパクレベルで認識された。そこで、当該N末端認識抗dystrophin抗体による免疫沈降(IP)とSDS-PAGEにより、低分子量dystrophinの新規複合体候補とみなされるものを含む画分に着目し質量分析(TOF-MS)(受託解析)を行った。複合体候補分子として、シナプス関連蛋白、CaM kinase IIが含まれ、入手できる市販抗体を用いて、IP後や2-D PAGE後のWB法で、新規複合体構成分子であることを確認した。
2.免疫組織化学的手法による解析
共焦点レーザ顕微鏡を用いた蛍光免疫組織化学により、1で確認された新規複合体構成分子と低分子量dystrophinが神経細胞シナプスにおいて共局在するかを確認した。胎生17.5日のマウス胎仔脳海馬神経細胞の初代培養細胞を用いて、分散培養10日後、突起伸長、シナプス形成を確認したのち、蛍光免疫三重染色を行った。すなわち、N末端認識抗dystrophin抗体、市販のC末端認識抗dystrophin抗体、1で確認された複合体候補シナプス関連分子に対する抗体を用いて、C末端を欠く低分子量dystrophinが複合体候補シナプス関連分子と特異的に共局在することを解析した(論文作成中)。
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