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今年度は、Conditional Gαs-KOおよびconditional Gαq-KOの作出、およびその骨組織の解析の準備をおこなった。マウスの作成については、今までの研究で、骨芽細胞においてGαqを介したシグナルに分化抑制作用があることが分かったが、Gαqのloss of functionについての解析は行われていない。コンベンショナルなGαs-、Gαq-KOマウスは両者ともにすでに作成されておいるが、Gαs-KOマウスは胎生初期に死亡してしまい、またGαq-KOマウスは胎生後期もしくは出生直後に血小板の異常により死亡してしまうため、骨量の変化が明らかとなる成人の骨の骨組織の解析が不可能である。そこで、両G蛋白の骨組織特異的なconditional KOマウスが必要となってくる。共同研究である東京大学ティッシュ・エンジニアリング部の研究協力者はこれまでKOマウスの作出、解析を数多く行ってきているので、その手法であるCre/loxPシステムを用いて作成した。両蛋白をfloxで挟み込んだターゲティングベクターを用いてfloxマウスの作製を行った。作出されたそれぞれのfloxマウスを、現在保有する骨芽細胞特異的にCreを発現するI型コラーゲン-Creマウスと交配させて、骨芽細胞特異的conditional KOマウスを作出した。
In vivoの解析:まず作成したconditional KOマウスが骨芽細胞特異的に遺伝子欠損を起こしうるかを、既存のI型コラーゲン-Creマウスと掛け合わせて作った新生児を用いて確認した結果、骨芽細胞特異的にGαs-、Gαq-の発現が抑制されていることが確認された。
In vitroの解析:各conditional KOマウス、および同胞WTマウス各由来の頭蓋骨由来の初代培養骨芽細胞および骨髄細胞を取り出し、骨芽分化系解析のための準備中である。
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