| 研究概要 |
本研究では1,25-dihydroxyvitamin D3を培養上皮細胞に添加し、上皮細胞の分化の促進と抗細菌性ペプチドであるβディフェンシン(hBD)-1、2、3およびLL-37の発現変化を観察することを目的とした。
ヒト正常表皮角化細胞(HaCaT細胞)を10%FBS含有DMEMにて培養を行い、1,25-dihydroxyvitamin D3を0(無添加)、1、10、100nM添加した。その後各濃度にて、4、8、24、48、72時間培養し、Trizol Reagent (invitrogen)を用いて、スクラッパーにより採取した細胞からTotal RNAを抽出し、Oligo(dt)_<12-18>Primerを用いてRT処理しcDNAの合成を行い、Real-time RT-PCRにてhBD-1、2、3およびLL-37mRNAの定量的発現解析を実施した。
また、同様にHaCaT細胞をチャンバースライドにて培養後、Real-time RT-PCRにて発現が著明に認められた時間・濃度の条件下にて、抗hBD-1、2、3と抗LL-37のポリクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行い、タンパクレベルでの発現を観察した。
HaCaT細胞において種々の時間や濃度でReal-time RT-PCRを行った結果、hBD-2、3、LL-37 mRNAにおいては、1,25-dihydroxyvitamin D3の添加濃度に比例し、発現が強く認められた。しかし、hBD-1 mRNAにおいては顕著な差は認められなかった。
免疫組織染色においても、hBD-3は1,25-dihydroxyvitamin D3を添加することによりチャンバースライド上にて強発現を呈するものの、hBD-1、2、LL-37では明確な染色像の差は見られなかった。
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