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経験依存的可塑性に伴う神経回路活動の変化をin vivo二光子イメージングで慢性観察する系を確立するために、平成21年度は蛍光カルシウムバイオセンサーの性能評価とそのマウス脳への発現法の検討を行った。
最初にCMVプロモーター下に蛍光カルシウムバイオセンサーGCaMP4遺伝子と発現マーカーDsRed2遺伝子を共発現するプラスミドDNAを遺伝子銃によって海馬培養スライスに導入した。高KCl細胞外液によってこれらの発現細胞を脱分極刺激したところ、細胞外カルシウム流入によりGCaMP4の蛍光強度が著しく増強することが確認できた。
次にこのGCaMP4-DsRed2カセットを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを作製し、マウス視覚皮質への微量注入を行った。注入動物から切片を作製し観察すると、感染細胞におけるGCaMP4とDsRed2の共発現が認められた。しかし動物ごとに感染細胞の細胞種と数と分布が異なることから、第2/3層の神経細胞に再現性よく感染させるためには、注入法の今後の改善が必要と考えられた。
トランスジェニックマウスの作製については、まずCaMKIIプロモーター下にテトラサイクリン依存性転写因子tTAを発現するマウスと、tet0オペレーター下にGCaMP2を発現するマウスを交配し、トランスジーン二重陽性の子孫マウスを観察したところ、嗅球、線条体、海馬にGCaMP2の中程度の発現を認めたが、大脳皮質にははっきりと認められなかった。この予備的結果を受け、より強力なthy1プロモーターを用いて皮質錐体細胞にGCaMP4-DsRed2カセットを発現するトランスジェニックマウスの作製を現在進めている。
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