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1.RNAへの変異導入による検出感度の改善
すでに作製済みであるtheophyllineを検出するRNAプローブ(theo-RRE)を元に、変異導入と配列延長による検出感度の改善を試みた。その結果、アウトプットシグナルを発するタンパク質プローブと結合する部位に変異を導入することにより、theophylline非存在下でのRNA-タンパク質間の結合を抑えて検出感度を高くすることができた。この知見は、今後のRNAプローブの効率的な設計に役立つと考えられる。
2.theophyllineを検出モデルとしたRNAセレクションの条件検討
Revペプチドの代わりにTatペプチドをRNA結合性ペプチドとして用いた。theophylline存在下においてTatペプチドとの結合を示すRNA配列を取得することを目的とし、RNAセレクションの条件検討を行った。まず、theophyllineアプタマーとTatペプチドに結合するTAR-RNAとの間にランダムなRNA配列を挿入したRNAライブラリを設計した。次に、theophylline非存在下でTatペプチドに結合するRNAを、Tatペプチドを固定化した磁性ビーズで回収(ネガティブセレクション)した。そして、結合しなかったRNAに対してtheophyllineを添加し、同様にTatペプチドに結合させて回収(ポジティブセレクション)した。このとき、結合反応溶液中にtRNAを共存させておくことによりRNAとTatペプチドとの非特異的な相互作用を抑え効率的にRNAを回収できることを確認した。また、回収したRNAから逆転写、PCR増幅、再転写の反応を経ることで、次のセレクションサイクルに使用するためのRNAライブラリを調整できることを確認した。今後、このサイクルを繰り返すことで上記の特性を示すRNA配列を取得できると考えられる。
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