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本研究は、真核生物における相同組換え修復に必須な相同鎖検索のメカニズム解明に貢献するため、我々が同定した新規相同組換えタンパク質EVLに着目し、(1)RAD51、EVL及びTOPOIIIαによって末端のない基質間で組換え反応を起こすかどうかの解明、(2)EVLによるRAD51の活性化メカニズムの解明を目指した。昨年度までに、RAD51及びTOPOIIIαにより環状単鎖DNAと超らせん環状二重鎖DNAの末端のないDNA基質間で複合体(ヘミカテマー)が形成されることを明らかにした。
また、EVLのC末端領域が、EVLの相同組換え修復における機能領域であることを示した。ヘミカテマーの形成量が少なかったことから、本年度はヘミカテマーの形成に最適な条件の探索を行った。RPAは相同組換えの初期過程において形成される単鎖DNAに結合し、試験管内でRAD51の鎖交換反応を促進することが明らかになっていた。そのことから、RPA存在下で同様の解析を行った。その結果、ヘミカテマーの形成量が著しく増加した。また、環状単鎖DNA及び超らせん環状二重鎖DNA混在下では、RPAによりTOPOIIIαの二重鎖DNAリラクゼーション活性が促進されることも示された。このようにして形成された多量体DNAは100℃下で熱変性を行っても解消されなかったことから、ヘミカテマーであることがさらに確かめられた。これらの解析から、RAD51、TOPOIIIα及びRPAが相同組換えの初期過程において協同的に働き、組換え中間体の安定化を促すことが示唆された。一方で、EVLのパラログであるVASP及びMENAについても生化学的解析を行い、RAD51の組換え活性の促進活性などのEVLと同様の相同組換えに関わる活性を有することが明らかになった。このことから、EVLの相同組換えにおける機能をVASP及びMENAが細胞内で補うことが示唆された。
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