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本研究では、細胞周期制御因子に対するSUMO修飾の有無とその意義を問うものである。本年度はin vitro SUMOylationアッセイを遂行するにあたり必須となるE1酵素と基質候補となる細胞周期関連因子群を、大腸菌による組換えタンパク質発現システムを用いて発現、精製するための実験系の条件検討を主に行った。これは、既存のE1酵素群の発現系が非常に貧弱であり、一度の発現、精製によって実験数回分のタンパクしか生成できなかったため、改良を要したことによる。本研究以前に報告されているE1発現系では、スモールサブユニットSAE1bとラージサブユニットSAE2とを共発現させていたが、これは大腸菌に対して毒性を持つ可能性が高く十分な発現量が得られていなかった。そこで、数種類の発現ベクターを用いて各遺伝子を個別にクローニングしてさらに菌株や誘導条件の検討を行った。その結果、既存のベクターを用いた場合に比べて100倍強の効率で酵素群を得ることに成功した。さらに、この新規ベクターを用いて発現、精製した酵素を用いたin vitro SUMO化アッセイを行い、SUMO E3 ligaseであるHPY2の自己SUMO化がおこなわれることを確認した。また、細胞周期関連因子群をGatewayテクノロジーによって多数クローニングしたベクターコレクションを作成し、これらを大腸菌発現用のベクターに導入して各種細胞周期関連因子群のGST融合型発現ベクターコレクションを作成した。次年度にはこれらの材料を用いてSUMO化される因子の探索とそれに続く機能解析を行う予定である。
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