研究課題
本研究の意義は、細胞周期制御因子に対するSUMO修飾の有無を検証するための実験システムを構築しスクリーニングを行うことで基質タンパクとしての可能性を明らかにするとともにさらなる実験に供する材料を得るものである。本年度は大腸菌による組換えタンパク質発現システムを用いたSUMO化の検証法を実行するに当たりその有効性の検証を行った。その結果、タンパク質の発現、精製に用いるタグにSUMOが結合し擬陽性を生じるケースが多々あることを確認した。そこで、新たに発現タグと消化のためのプロテアーゼの組み合わせや検出条件の検討を行った。その結果、GSTやMBPなどの擬陽性を生じる可能性を持つタグを除くとともに、蛍光染色剤やHAタグなどのリジン残基を持たないタグを用いたウェスタンブロットなどの方法で確実にSUMO化を検出することに成功した。これにより追加の実験などの確認を待たずにin vitroの実験のみでSUMO化の有無を確定し効率的にスクリーニングを行うことが可能となった。この新システムを用いてSUMO E3 ligaseであるHPY2の自己SUMO化がおこなわれることを確認した。MBPタグ、GSTタグとも有効にHPY2が発現するとともに、SUMO化による分子量の増大を検出することができた。また、プロテアーゼ処理によりタグを除いた際にもHPY2に結合したSUMOは残存したためHPY2自身が大腸菌によるSUMO経路再構築系でSUMO化されうることを示した。さらに、新システムに対応した発現ベクターに細胞周期関連因子群のライブラリーをクローニングしスクリーニングシステムの構築完了とした。本システムを用いて細胞周期制御に対するSUMO制御の意義を探る研究が大きく展開することが期待される。
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