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昨年度までの検討で、DNA修飾有機半導体ポリマー蛍光ナノ粒子(Pdot)の合成、及びこれらの逐次集積によるタンパク質マーカーの高輝度ラベル化手法を確立することができた。これを踏まえ2023年度は、DNAを介したタンパク質マーカーへの結合と解離の繰り返し機構を導入し、超マルチカラーイメージングの実現可能性を検討した。
まず、抗体に一本鎖DNAを修飾し、リンカーDNAを介して二重らせん形成によって一本鎖DNA修飾Pdotを結合する系を構築した。この際、リンカーDNA配列の中心部分に、抗体側ともPdot側とも２重らせんを組まないミスマッチ領域を導入することで、リンカーDNAと完全に相補的な一本鎖DNA(解離DNA)を加えた際に、二重らせん構造の組み換えによってPdotが抗体から解離するよう設計を行った。
続いて、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株であるA431細胞に対し、6つのマーカー(EGFR、CD44、ICAM-1、E-Cadherin、CD24、インテグリンbeta1)を対象として蛍光色素を用いたマルチカラーイメージングを検討した。まず1stサイクルとしてEGFR、CD44、ICAM-1に対して異なる蛍光色素をリンカーDNAを介して結合させ、蛍光像を取得後、解離DNAを加えることでこれらを解離させた。その後、同様にE-Cadherin、CD24、インテグリンbeta1を染色し、蛍光像を取得した。これら６種のシグナルに対し疑似カラーを割り当て重ね合わせることで、６種のタンパク質マーカーの発現空間パターンを、一つの画像上で可視化することができた。今回実証された超マルチカラーイメージングの方法論と、昨年度までに構築したPdotの高輝度集積技術を統合することで、無数の種類のタンパク質マーカー発現の空間パターンを高感度かつ一度に可視化可能な、新たな解析技術基盤となることが期待される。
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