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我々が開発したアデニル化酵素を用いる化学酵素的アミド結合形成反応によるキラリティ制御可能な汎用性の高いアミド化合物合成法を基盤として、非標準型アミノ酸を含むジペプチドや環状ジペプチドであるジケトピペラジン(DKP)やジケトモルフォリン(DKM)のような特殊構造を有する多様なペプチドの創製と効率的な合成法を検討した。昨年度までに、非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)のアデニル化ドメインを単独発現させることで、生理基質であるL-アミノ酸のみならずD-アミノ酸やその他の数種類のアミノ酸もアデニル化する興味深い現象を見出し、さらにα-ケト酸や対応するα-ヒドロキシ酸も基質としてアデニル化することを明らかにした。
今年度は、とくに寛容な基質特異性を有するチロシジン合成酵素由来のアデニル化ドメインに着目し、ジペプチドなどオリゴペプチドのアデニル化の可能性を検討した。すなわち、ジペプチドをアデニル化基質として認識すれば、我々が開発したアミド結合形成反応によって、ヘテロジペプチドの求核的な連結によるテトラペプチドの合成が可能になり、実用的なオリゴペプチド合成プロセスの開発につながる。
また、DKPやDKMの効率的な合成法を検討した。DKP合成ではこれまでのアデニル化ドメインに加え、ジペプチド合成活性の高いL-アミノ酸α-リガーゼ(Lal)を用いる方法も検討した。さらに、求核剤としてアミノ酸のメチルエステル体を利用しないDKPやDKMの合成法の開発を検討した。
その他、機能性ジペプチドβ-Ala-DOPAのLalを用いる効率的合成法を昨年までに開発したが、汎用性を高めるため、ポリリン酸キナーゼとの共役反応を組み込み、ATP添加を抑制した低コストプロセスとなる酵素反応系を構築し、任意L-アミノ酸Xaaから成るジペプチドXaa-DOPAのXaa-Tyrを経由する変換プロセスの開発も検討した。
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