機械刺激を加えた単一タンパク質の構造および力学特性応答の高速AFM解析

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H01772
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 内橋 貴之 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (30326300)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 高速原子間力顕微鏡 / 微小管 / キネシン / 動態解析 / 機械ストレス / 一軸伸長機構

研究実績の概要

本年度はタンパク質に引っ張りや圧縮などの機械的ストレスを印加するために基板伸縮機構を有する高速AFMの開発を行った。従来のサンプル走査型高速AFMでは試料のサイズが限定されることから、基板伸縮機構等の試料操作機構を組み込むことは不可能であった。そこで、試料サイズの自由度が高く、基板伸縮機構のための空間確保が可能なプローブ走査型高速AFMを新たに開発した。この装置の試料ステージに弾性基板を両端からステッピングモーターで引張/圧縮が可能な一軸伸長機構を組み込んだ。開発したプローブ走査型高速AFMで、GroELやアクチンフィラメント、アクチニンによるアクチンフィラメントの架橋構造の観察を行うことができ、本装置がタンパク質の構造破壊や機能を阻害することなくイメージングできることを確認できた。
次に弾性体であるPDMS基板への微小管の固定方法を検討した。キネシン-1の疎水的部位であるカーゴ結合サイトを疎水性PDMS表面に疎水性相互作用により結合させ、そこに微小管を導入することで、キネシン-1の微小管結合サイトに微小管を結合させた。さらに、0.01%のグルタルアルデヒドでアミノ基架橋を行うことでキネシン-1と微小管を強固に結合させ、ATP存在下でも微小管がスライディング運動しないようにした。さらにPDMS基板とキネシン-1との非特異吸着を防ぐためにカゼインをブロッキング剤として使った。基板伸縮機構によってキネシン修飾PDMS基板を伸長した後、微小管を表面に固定して、伸長状態を解放することで微小管に圧縮力を加えた。自然長の状態では比較的直線の構造を持つ微小管が観察され、約14%圧縮すると複数箇所で屈曲した微小管が観察されるようになった。さらに圧縮すると、微小管の座屈による破断も観察され、微小管を構造的な限界まで屈曲させる事が出来た。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

一軸伸長機構付きのプローブ走査型高速AFMを開発し、アクチニンによるアクチンフィラメントの架橋構造の観察を行うことができ、本装置がタンパク質の構造破壊や機能を阻害することなくイメージングできることを確認できたこと。また、弾性PDMS基板に微小管を固定して一軸伸長機構によって微小管の屈曲を制御できたことから、計画通りに研究が進捗していると考える。

今後の研究の推進方策

微小管の屈曲制御とキネシンの滑走運動の観察と解析：開発した一軸伸長機構付き高速AFMを用いて基板伸縮により微小管の屈曲を連続的に制御することで、キネシンの滑走運動に及ぼす影響を詳細に解析することで、微小管のメカノセンサー機能に関する包括的な理解を得る。
アクチン線維ネットワークの力学操作とアクチン結合タンパク質の親和性変化の解析：弾性シート基板表面にビオチン化脂質を含んだ平面脂質二重膜を展開し、一部ビオチン化したアクチン線維をストレプトアビジン分子を介して脂質膜に固定する。アクチンストレスファイバーを模すために、α-アクチニンによるアクチン線維の架橋とバンドル化を行い基板に固定する。溶液中にはコフィリンあるいはミオシンIIのアクチン結合部位であるS1部を入れておく。弾性基板の引張でアクチンネットワークに力学負荷をかけながら、アクチン線維の構造変化（らせんピッチとG-アクチンの間隔）とコフィリンおよびS1の結合・解離を観察し、アクチン線維の局所構造の張力依存的変化と結合タンパク質の親和性変化の相関を明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Shape-selective one-step synthesis of branched gold nanoparticles on the crystal surface of redox-active PdII-macrocycles (2022)
  • 著者名/発表者名: Yutaro Yamashita, Shohei Tashiro, Yoshiki Ishii,Takayuki Uchihashi, Nobuyuki Matsushita, Ryou Kubota, and Mitsuhiko Shionoya
  • 雑誌名: Dalton Transactions 巻: 51 ページ: 1318-1324
  • DOI: 10.1039/D1DT03973C
  • 査読あり
• [雑誌論文] Protein Needles Designed to Self-Assemble through Needle Tip Engineering (2022)
  • 著者名/発表者名: Kosuke Kikuchi, Tatsuya Fukuyama, Takayuki Uchihashi, Tadaomi Furuta, Yusuke T. Maeda, and Takafumi Ueno
  • 雑誌名: Small 巻: 18 ページ: 2106401
  • DOI: 10.1002/smll.202106401
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quantitative Visualization of the Interaction between Complement Component C1 and Immunoglobulin G: The Effect of CH1 Domain Deletion (2022)
  • 著者名/発表者名: Saeko Yanaka, Shigetaka Nishiguchi, Rina Yogo, Hiroki Watanabe, Jiana Shen, Hirokazu Yagi, Takayuki Uchihashi, and Koichi Kato
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences, 巻: 23 ページ: 2090
  • DOI: 10.3390/ijms23042090
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] JRAB/MICAL-L2 undergoes liquid?liquid phase separation to form tubular recycling endosomes (2021)
  • 著者名/発表者名: Ayuko Sakane, Taka-aki Yano, Takayuki Uchihashi, Kazuki Horikawa, Yusuke Hara, Issei Imoto, Shusaku Kurisu, Hiroshi Yamada, Kohji Takei and Takuya Sasaki
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 ページ: 551
  • DOI: 10.1038/s42003-021-02080-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Reconstruction of Three-Dimensional Conformations of Bacterial ClpB from High-Speed Atomic-Force-Microscopy Images (2021)
  • 著者名/発表者名: Bhaskar Dasgupta, Osamu Miyashita, Takayuki Uchihashi and Florence Tama
  • 雑誌名: Frontiers in in Molecular Biosciences: Biological Modeling and Simulation 巻: 8 ページ: 704274
  • DOI: 10.3389/fmolb.2021.704274
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Tardigrade Secretory-Abundant Heat-Soluble Protein Has a Flexible β-Barrel Structure in Solution and Keeps This Structure in Dehydration (2021)
  • 著者名/発表者名: Kazuhisa Miyazawa, Satoru G. Itoh, Hiroki Watanabe, Takayuki Uchihashi, Saeko Yanaka, Maho Yagi-Utsumi, Koichi Kato, Kazuharu Arakawa, and Hisashi Okumura
  • 雑誌名: Journal of Physical Chemistry B 巻: 125 ページ: 9145_9154
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.1c04850.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Deformation of microtubules regulates translocation dynamics of kinesin (2021)
  • 著者名/発表者名: Syeda Ruvaiya Nasrin, Christian Ganser, Seiji Nishikawa, Arif MD. Rashedul Kabir, Kazuki Sada, Takefumi Yamashita, Mitsunori Keguchi, Takayuki Uchihashi, Henry Hess, and Akira Kakugo
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 7 ページ: eabf2211
  • DOI: 10.1126/sciadv.abf2211
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Desiccation-induced fibrous condensation of CAHS protein from an anhydrobiotic tardigrade (2021)
  • 著者名/発表者名: Maho Yagi-Utsumi, Kazuhiro Aoki, Hiroki Watanabe, Chihong Song, Seiji Nishimura, Tadashi Satoh, Saeko Yanaka, Christian Ganser, Sae Tanaka, Vincent Schnapka, Ean Wai Goh, Yuji Furutani, Kazuyoshi Murata, Takayuki Uchihashi, Kazuharu Arakawa and Koichi Kato
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 11 ページ: 21328
  • DOI: 10.1038/s41598-021-00724-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Construction of ferritin hydrogels utilizing subunit_subunit interactions (2021)
  • 著者名/発表者名: Masaru Yamanaka, Tsuyoshi Mashima, Michio Ogihara, Mei Okamoto, Takayuki Uchihashi, and Shun Hirota
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 16 ページ: e0259052
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0259052
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular Origin of the Anomalous pH Effect in Blue Proteorhodopsin (2021)
  • 著者名/発表者名: Mizuki Sumikawa, Rei Abe-Yoshizumi, Takayuki Uchihashi, and Hideki Kandori
  • 雑誌名: Journal of Physical Chemistry Letters 巻: 12 ページ: 12225-12229
  • DOI: 10.1021/acs.jpclett.1c03355
  • 査読あり
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡で可視化する生体/人工分子の一分子ダイナミクス (2022)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: 明治薬科大学大学院フロンティアシンポジウム: 生命への架け橋
  • 招待講演
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡で撮影するタンパク質の機能動態 (2021)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: 第21回 日本蛋白質科学会年会： WS5. 高速分子動画：タンパク質の構造機能相関研究の最先端
  • 招待講演
• [学会発表] 高速AFMによる高分子ゲル微粒子の構造物性動態イメージング (2021)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: 第70回高分子討論会: S6. ソフトマテリアルイメージングの最前線
  • 招待講演
• [図書] "Microtubule Preparation for Investigation with High-Speed Atomic Force Microscopy": PART V: Analysis of Microtubule Dynamics and Structures, 22 in Microtubules : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Hiroshi Inaba Ed.) (2022)
  • 著者名/発表者名: Christian Ganser and Takayuki Uchihashi
  • 総ページ数: -
  • 出版者: Springer
  • ISBN: 978-1071619827
• [図書] 「図説 表面分析ハンドブック」(日本表面真空学会 編集)： 23.8「高速原子間力顕微鏡」 (2021)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 総ページ数: 576
  • 出版者: 朝倉書店
  • ISBN: 978-4-254-20170-3
• [図書] "Single-Molecule Methods Applied to Circadian Proteins with Special Emphasis on Atomic Force Microscopy": pp. 147-178 in Circadian Rhythms in Bacteria and Microbiomes (C. H, Johnson and M. J. Rust Eds) (2021)
  • 著者名/発表者名: Tetsuya Mori and Takayuki Uchihashi
  • 総ページ数: -
  • 出版者: Springer
  • ISBN: 978-3-030-72158-9
• [図書] 実験医学別冊 「創薬研究のための相互作用解析パーフェクト: 低中分子・抗体創薬におけるスクリーニング戦略と実例、in silico解析、一歩進んだ分析技術まで」(津本浩平，前仲勝実 編)： 第3章 ひとつ進んだ相互作用の理解をめざして: 5．高速原子間力顕微鏡によるタンパク質間動的相互作用の一分子計測 (2021)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 総ページ数: 368
  • 出版者: 羊土社
  • ISBN: 978-4-7581-2256-6