遺伝コード修復治療の研究-人為的RNA編集によるRNAの変異修復

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H02067
• 研究機関: 北陸先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 塚原 俊文 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 特任教授 (60207339)
• 研究分担者: 竹中 瑞樹 京都大学, 理学研究科, 准教授 (10796163) ; 青木 吉嗣 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部, 部長 (80534172)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: RNA編集 / 遺伝コード修復 / PPRタンパク質 / DYW相同体 / 脱アミノ化酵素 / アミノ転移酵素 / MS2システム / 疾患治療

研究実績の概要

本研究では、遺伝子の点変異を原因とする疾患に対する治療法として、人為的なRNA編集を利用して、発現している変異RNAの遺伝コードを部位特異的に修復して疾患を治療するという、遺伝コード修復による疾患治療法の確立を目指している。これまでにADAR１を用いたA⇒I(G) RNA編集およびAPOBEC１を用いたC⇒U RNA編集のいずれにおいても、標的RNAに相補的な配列の両側に1つのMS2ループRNAを付加したガイドRNAの開発によってRNA編集効率を50%程度に向上させることに成功した。劣性遺伝形式の疾患では片方のアリル遺伝子が正常であれば疾患は発症しないことから、発現するRNAの約半量が修復されたことは、本法の実用化に向けた壁の一つがクリアされたと考えている。
一方、植物のRNA編集の研究では、ツノゴケ由来PPRタンパク質のDYWドメインを酵素として利用し、ヒト細胞内でのほぼ100%のC⇒U RNA編集に成功した。さらにDYWに相同性を有する2つのドメイン（GRPおよびDRH）遺伝子断片を単離し、PPR56とその標的遺伝子nad4を利用した大腸菌アッセイ系でRNA編集活性を調べたところ、GRPドメインはアミノ基供与体としてアスパラギンを添加した場合にU⇒C RNA編集活性を、DRHドメインはG⇒A変換活性を示すことが示された。これらの結果はいずれも世界初の発見であり、U⇒C RNA編集活性については多くのナンセンス変異を原因とする疾患への応用が可能となると期待される。さらに、DRHドメインがG⇒A変換を触媒することは、他の生物も含めてこれまで知られていない機構であった。この変換はGを脱アミノ化してキサントシン(X)とすることで、遺伝暗号はAとして認識されるという新たなRNA編集と考えられた。これらツノゴケ由来のRNA編集活性を利用した人為的RNA編集の可能性が明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は、遺伝子の点変異を原因とした疾患に対する治療法として、変異RNAを人為的RNA編集によって修復する方法の確立を目的としているが、我々はこれまでにADAR1およびAPOBEC1の活性部位と標的RNAに相補的なガイドRNAをMS2システムを介して結合させることで人工RNA編集酵素複合体を創成し、塩基配列特異的な細胞内RNAのA⇒I(G)およびC⇒U変換を誘導に成功し、さらにツノゴケPPRタンパク質のDYWドメインに相同性を有する2つのドメイン（GRPおよびDRH）遺伝子断片のRNA編集活性を検討し、GRPドメインはアミノ基供与体としてアスパラギンを添加した場合にU⇒C RNA編集活性を、DRHドメインはGを脱アミノ化してキサントシン（X）とすることで、遺伝暗号はAとして認識されることが示され、これらツノゴケ由来のRNA編集活性を利用した人為的RNA編集の可能性が明らかにした。
これまでの研究成果としては、塚原らは、MDPIのIJMS、Genes、Applied Sciences 誌等に、竹中らはPlant Cell誌等、青木らはNeurology & Clinical Neuroscienc誌等にそれぞれ研究成果を発表しており、また我々と竹中の共著論文も準備中である。実用化の面では、昨年度に申請した特許について、JSTの支援によってPCT出願も行い、海外における権利化の可能性も開拓し、さらに予想外なことにこれまで知られていなかったGを脱アミノ化してXとし、遺伝コードとしてはAと認識させる機構を発見してその特許化を準備している。今後、動物実験による人為的RNA編集による遺伝コード修復の検証が必要であるが、既に青木らによって遺伝子導入用のアデノ随伴ウイルスベクターの構築も進行しており、今後の研究実施に支障はない。従って、本研究は順調に進捗していると考えている。

今後の研究の推進方策

本研究は、遺伝子の点変異を原因とした疾患に対する治療法として、変異RNAを人為的RNA編集によって修復する方法の確立を目的としているが、我々はこれまでにADAR1およびAPOBEC1の活性部位と標的RNAに相補的なガイドRNAをMS2システムを介して結合させることで人工RNA編集酵素複合体を創成し、塩基配列特異的な細胞内RNAのA⇒I(G)およびC⇒U変換の誘導に成功し、さらにツノゴケPPRタンパク質のDYWドメインに相同性を有する2つのドメイン（GRPおよびDRH）遺伝子断片のRNA編集活性を検討し、GRPドメインはアミノ基供与体としてアスパラギンを添加した場合にU⇒C RNA編集活性を、DRHドメインはGを脱アミノ化してキサントシン（X）とすることで、遺伝暗号はAとして認識されることが示され、これらツノゴケ由来のRNA編集活性を利用した人為的RNA編集の可能性が明らかになった。
令和4年度の研究成果としては、塚原らは、MDPIのIJMS、Genes、Applied Sciences 誌等に、竹中らはPlant Cell誌等、青木らはNeurology & Clinical Neuroscience誌等にそれぞれ研究成果を発表しており、また塚原と竹中の共著論文も投稿中である。実用化の面では、昨年度に申請した特許について、JSTの支援によってPCT出願も行い、海外における権利化の可能性も開拓した。さらに予想外なことにこれまで知られていなかったGを脱アミノ化してXとし、遺伝コードとしてはAと認識させる機構を発見してその特許化を準備している。
今後、動物実験による人為的RNA編集による遺伝コード修復の検証が必要であるが、既に青木らによって遺伝子導入用のアデノ随伴ウイルスベクターの構築も進行しており、今後の研究実施に支障はない。従って、本研究は順調に進捗していると考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Increasing the Editing Efficiency of the MS2-ADAR System for Site-Directed RNA Editing (2023)
  • 著者名/発表者名: J Li, T Oonishi, G Fan, M Sakari, T Tsukahara
  • 雑誌名: Appl. Sci. 巻: 13 ページ: 13042383
  • DOI: 10.3390/app13042383
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing (2022)
  • 著者名/発表者名: Ruchika, Toshifumi Tshukahara, Manish Biyani
  • 雑誌名: Journal of Visualized Experiment 巻: - ページ: 3591-v
  • DOI: 10.3791/63591-v
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development of Therapeutic RNA Manipulation for Muscular Dystrophy (2022)
  • 著者名/発表者名: Saifullah, N Motohashi, T Tsukahara, Y Aoki
  • 雑誌名: Frontiers in Genome Editing 巻: 4 ページ: 863651
  • DOI: 10.3389/fgeed.2022.863651
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Integrated analysis of ALK higher expression in human cancer and downregulation in LUAD using RNA molecular scissors (2022)
  • 著者名/発表者名: Saifullah, T Tsukahara
  • 雑誌名: Clinical and Translational Oncology 巻: 24 ページ: 1785–1799
  • DOI: 10.1007/s12094-022-02835-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Integrated analysis of the clinical consequence and associated gene expression of ALK in ALK-positive human cancers (2022)
  • 著者名/発表者名: Saifullah, T Tsukahara
  • 雑誌名: Heliyon 巻: 8 ページ: e09878
  • DOI: 10.1016/j.heliyon.2022.e09878
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] C-to-U RNA Editing: A Site Directed RNA Editing Tool for Restoration of Genetic Code (2022)
  • 著者名/発表者名: S Bhakta, T Tsukahara
  • 雑誌名: Genes 巻: 13 ページ: 13091636
  • DOI: 10.3390/genes13091636
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The Role of the Exonic lncRNA PRKDC-210 in Transcription Regulation by Junling Mo (2022)
  • 著者名/発表者名: J Mo, G Fan, T Tsukahara, M Sakari
  • 雑誌名: Int. J. Mol. Sci 巻: 23 ページ: 232213783
  • DOI: 10.3390/ijms232213783
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Investigating the role of dystrophin isoform deficiency in motor function in Duchenne muscular dystroph (2022)
  • 著者名/発表者名: Mary Chesshyre, Deborah Ridout, Yasumasa Hashimoto, Yoko Ookubo, Silvia Torelli, Kate Maresh, Valeria Ricotti, Lianne Abbott, Vandana Ayyar Gupta, Marion Main, Giulia Ferrari, Anna Kowala, Yung-Yao Lin, Francesco Saverio Tedesco, Mariacristina Scoto, Giovanni Baranello, Adnan Manzur, Yoshitsugu Aoki, Francesco Muntoni
  • 雑誌名: Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle 巻: 13 ページ: 1360-1372
  • DOI: 10.1002/jcsm.12914
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Clinical development of novel therapies for Duchenne muscular dystrophy-Current and future (2022)
  • 著者名/発表者名: Tsukasa Tominari, Yoshitsugu Aoki
  • 雑誌名: Neurology and Clinical Neuroscience 巻: - ページ: 12691
  • DOI: 10.1111/ncn3.12691
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] DYW deaminase domain has a distinct preference for neighboring nucleotides of the target RNA editing sites (2022)
  • 著者名/発表者名: Ayako Maeda, Sachi Takenaka, Tenghua Wang, Brody Frink, Toshiharu Shikanai, Mizuki Takenaka
  • 雑誌名: Plant Journal 巻: 111 ページ: 756-757
  • DOI: 10.1111/tpj.15850
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural insight into the activation of an Arabidopsis organellar C-to-U RNA editing enzyme by active site complementation (2022)
  • 著者名/発表者名: Sachiko Toma-Fukai, Yuto Sawada, Ayako Maeda, Hikaru Shimizu, Toshiharu Shikanai, Mizuki Takenaka, Toshiyuki Shimizu
  • 雑誌名: Plant Cell 巻: - ページ: koac318
  • DOI: 10.1093/plcell/koac318
  • 査読あり
• [産業財産権] 酵素、複合体、組換えベクター、遺伝性疾患治療薬及びポリヌクレオチド (2022)
  • 発明者名: 塚原俊文、
  • 権利者名: 北陸先端科学技術大学院大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2022/ 47410
  • 外国