遺伝コード修復治療の研究-人為的RNA編集によるRNAの変異修復

2023 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H02067
• 研究機関: 北陸先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 塚原 俊文 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 名誉教授 (60207339)
• 研究分担者: 竹中 瑞樹 京都大学, 理学研究科, 准教授 (10796163) ; 青木 吉嗣 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部, 部長 (80534172)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: RNA編集 / 遺伝コード修復 / ツノゴケ / DYWドメイン相同体 / GRPドメイン / DRHドメイン / PPR56

研究実績の概要

本研究は遺伝子の点変異を原因とする疾患に対する治療法として、発現しているmRNAの変異塩基を人工酵素複合体の導入によって修復し、疾患を治療する方法の確立を目的としている。これまでにツノゴケPPRタンパク質のDYWドメインに相同性を有する2つのドメイン（GRP及びDRH）のＲＮＡ編集活性を検索し、大腸菌ではGRPがアミノ基供与体依存的にＵ⇒Ｃ ＲＮＡ編集活性を、ＤＲＨがG⇒X RNA編集の結果、Ａへの変換活性を有することを明らかにした。2023年度はこれら人為的RNA編集をヒト由来細胞で実現することを目指して実験を行った。
まず従来のMS2システムの実験系でGRP或いはDRHドメインによるRNA編集を試みたが、残念ながら相補的RNA鎖を用いるこの実験系ではHEK293細胞でのポジティブな結果は得られなかった。そこで、ナンセンス変異導入EGFP或いは開始コドンATGをGAGに変換したEGFPの上流にPPR56認識配列を挿入し、PPR56-GRP或いは同-DRH融合タンパク質遺伝子と共発現させたところ共に弱いながらも緑色蛍光が検出された。これはそれぞれGRPによって終止コドンのUが変換されたこと、或いはDRHによって開始コドンが修復されたことを示唆する。今後の改良が必要ではあるが、人為的U-to-U或いはG-to-A RNA編集が可能であることが示された。
また、より高効率な人為的C-to-U変換のためにより高活性のRNA編集酵素の検索を行い、APOBEC3A及び3Gを利用した人為的RNA編集ツールの開発も実施し、MS2システムを用いた標的mRNA認識において、標的塩基部分が1本鎖となる様にループ形状となる guide RNAを用いることで効率よく人為的ＲＮＡ編集が実現できることが示された。これらの研究成果により、人為的RNA編集を利用した疾患治療が可能である事が明らかとなった。

現在までの達成度 (段落)

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] University of Southampton(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: University of Southampton
• [国際共同研究] 紹興文理学院(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: 紹興文理学院
• [国際共同研究] University of Rajshahi(バングラデシュ)
  • 国名: バングラデシュ
  • 外国機関名: University of Rajshahi
• [雑誌論文] Improvement of C‐to‐U RNA editing using an artificial MS2‐APOBEC system (2023)
  • 著者名/発表者名: Jiarui Li, Guangyao Fan, Matomo Sakari, Toshifumi Tsukahar
  • 雑誌名: Biotechnology Journal 巻: 19 ページ: 230032
  • DOI: 10.1002/biot.202300321
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Examination of factors affecting site-directed RNA editing by the MS2-ADAR1 deaminase system (2023)
  • 著者名/発表者名: Md Thoufic Anam Azad, Umme Qulsum, and Toshifumi Tsukahara
  • 雑誌名: Genes 巻: 14 ページ: 1584
  • DOI: 10.3390/genes14081584
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 4.MEF2C/p300-mediated epigenetic remodeling promotes the maturation of induced cardiomyocytes (2023)
  • 著者名/発表者名: Hidenori Kojima, Taketaro Sadahiro, Naoto Muraoka, Hiroyuki Yamakawa, Hisayuki Hashimoto, Ryota Ishii, Masahiko Gosho, Yuto Abe, Yu Yamada, Koji Nakano, Seiichiro Honda, Ryo Fujita, Tatsuya Akiyama, Yoichi Sunagawa, Tatsuya Morimoto, Toshifumi Tsukahara, Hiroyuki Hirai, Keiichi Fukuda and Masaki Ieda
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 18 ページ: 1274 - 1283
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2023.05.001
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 5.Increasing the Editing Efficiency of the MS2-ADAR System for Site-Directed RNA Editing (2023)
  • 著者名/発表者名: Jiarui Li, Tomoko Oonishi, Guangyao Fan, Matomo Sakari and Toshifumi Tsukahar
  • 雑誌名: Applied Sciences 巻: 13 ページ: 2383
  • DOI: 10.3390/app13042383
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Identification of Zinc Finger (ZnF) Genes that Undergo Tissue-specific Alternative Splicing in Arabidopsis thaliana (2023)
  • 著者名/発表者名: Umme Qulsum, Md Thoufic Anam Azad, Toshifumi Tsukahara
  • 雑誌名: Egyptian Journal of Botany 巻: 63 ページ: 292
  • DOI: 10.21608/ejbo.2023.189961.2247
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Artificial RNA editing for genetic cord restoration (2023)
  • 著者名/発表者名: Toshifumi Tsukahara
  • 学会等名: BIOLOGICS AND BIOSIMILARS; ADVANCES IN MEDICINAL CHEMISTRY & PHARMACOLOG
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Artificial RNA Editing toward Treatment for Diseases Caused by Point Mutation (2023)
  • 著者名/発表者名: Toshifumi Tsukahara
  • 学会等名: Gene and Cell Technology Conference 2023
  • 国際学会 / 招待講演
• [産業財産権] 酵素、酵素複合体、および、これらの利用 (2023)
  • 発明者名: 塚原 俊文、范 光輝
  • 権利者名: 株式会社GeCoRT
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2023-185814