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トマトACC合成酵素(SlACS)を脱リン酸するprotein phosphatase PP2Aを同定する予定だった。特にその中で脱リン酸する基質を決めるPP2AのBサブユニットを同定する必要がある。これまでのアラビドプシスの解析から、Bサブユニットの中でも、B”サブユニットグループが候補となった。ここで本来の目的であるトマトのPP2Aに材料を変えた。B”サブユニットグループ内に5つのサブユニットがあり、どのサブユニットが結合するか明らかにする必要があった。これらのB”サブユニットcDNAをクローニングした。以前にyeast two hybrid systemで相互作用の検出を試みたが、うまくいかなかったのでACC合成酵素のタンパク質間相互作用を明らかにするために、AlphaScreen法で解析した。トマトSlACS2のC末端にはFlagアミノ酸配列を付加し、B”サブユニットタンパク質のN末端にmycアミノ酸配列を付加した。両タンパク質ともに小麦胚芽無細胞タンパク質合成系で合成し相互作用を解析したが、タンパク質間相互作用を明らかにすることができなかった。元々PP2Aはリン酸化タンパク質を相手にするので、SlACS2をリン酸化酵素CDPKでリン酸化する、あるいはSlACS2のリン酸化されるセリン残基をアスパラギン酸残基に変換して擬リン酸化状態にして、タンパク質間相互作用を解析するという戦略を取ったが、成果が出なかった。基本的にin vitro状態でタンパク質間相互作用を明らかにしようと試みたが成果はでなかった。そこでCRISPR/Cas9システムで特定のB”サブユニットをノックアウトし、形質転換体から表現型を解析することにした。B”型サブユニットは配列の類似性から3種類あるが、CRISPR/Cas9システムならばB、B’型に付いても解析できる。しかし、まだ成果はでていない。
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