| 研究課題/領域番号 |
21H02372
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
後飯塚 僚 東京理科大学, 研究推進機構生命医科学研究所, 教授 (50301552)
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| 研究分担者 |
樋上 賀一 東京理科大学, 薬学部生命創薬科学科, 教授 (90253640)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 胎生期 / B細胞 / 免疫 / 早期ライフステージ |
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| 研究実績の概要 |
RAG2-tTA-Tet-OFFおよび RAG2-rtTA-Tet-ONマウスを用いて、胎児期、新生児期、成体期にRAG2を発現した履歴のあるリンパ球系細胞を標識し、12~18週齢マウスの腹腔におけるB-1a(CD5+CD11b+)、B-1b (CD5+CD11b-)およびB-2 (CD5-CD11b-)細胞、脾臓におけるB-1 (CD5+~lowB220low~-) とB-2(CD5-B220+)細胞への寄与について解析を行った。その結果、腹腔B-1a細胞の約20%が胎児由来、40％が新生児由来、10%が成体由来であることが判明した。また、脾臓においては、B-1細胞の約20%、80%が胎児および新生児由来で、成体由来の細胞はほとんど検出されなかった。さらに、B-1細胞の特徴の一つである自己反応性と厳密に関連している細胞膜と細菌細胞壁の両方に共通するリン脂質であるホスファチジルコリン（PtC）に反応する細胞群における寄与を解析したところ、胎児由来の細胞が、その一部を占め、残りは新生児に由来することが明らかになった。このPtCに反応するB細胞抗原受容体(BCR) のクロノタイプはIgH/IgL鎖がVH 11/ Vk14とVH 12/ Vk 4から構成されることが知られており、そこで、抗VH 11抗体および抗VH 12抗体を用いて検討した結果、VH 11を発現するB-1細胞は胎児期、新生児期に発生するのに対して、VH 12を発現するB-1細胞の発生は胎児期にはほとんど検出されず、新生児期から出現することが判明した。以上の結果は、成体のB-1細胞プールは、様々な発生段階に由来する細胞から構成されており、主に胎児期、新生児期に由来する細胞が支配的であるが、胎児期と新生児期の間でも質的差異(BCRクロノタイプなど)が存在することを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
胎児期にRAG2遺伝子を発現した履歴のあるB細胞は成体においてはB-1細胞の一部として脾臓および腹腔で維持されており、それらにはPtCと反応するBCRクロノタイプを発現する細胞と発現しない細胞が存在するという知見に基づき、これらの細胞をtdTomato+/-（胎児由来とそれ以外）とPtC reactivity+/-（自己反応性とそれ以外）の指標を用いて4つに分画し、RNA-seqデータをTrust4アルゴリズムによりIgH/IgLレパトアを比較検討した。まず、PtC反応性のレパトアは、胎児由来B細胞では腹腔と脾臓いずれにおいても90%以上がIGVH11-2/D2-1(D1-1,D2-5)/J1から構成され、一方、胎児由来以外の細胞では約60％がIGVH11-2/D2-1(D1-1,D2-5)/J1、残りの約20%がIGVH12-3/D2-1(D2-3)/J1, 2,3から構成されていた。抗原との結合に密接に関連するV-D-J結合部でもあるCDR3の長さはIGVH11-2タイプで胎児型が13アミノ酸残基であるのに対し、胎児に由来しない細胞では14アミノ酸残基、IGVH12-3タイプでは19アミノ酸残基と、より長い傾向が認められ、Nヌクレオチドの挿入が存在することが示唆された。次に、PtCに反応しないB細胞のレパトアであるが、胎児に由来するB細胞では腹腔の50%、脾臓の85%がIGHV4-1/D1-1/J1を発現するレパトアであり、CDR3の長さは15アミノ酸残基で、アミノ酸配列も均一であることから、PtC以外の特定の抗原を認識している可能性が考えられる。以上の結果から、胎児に由来するB-1細胞レパトアにはPtCに反応するIGVH11-2/D2-1/J1タイプと反応しないIGHV4-1/D1-1/J1タイプの二つのサブセットが存在することが明らかになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
胎児に由来するB-1細胞のRNA-seqによる遺伝子発現解析により、PtCに反応しないサブセットの中で、腹腔ではなく、脾臓に局在する細胞で、二量体IgAの形成・粘膜上皮外へのポリIgレセプターを介したトランスサイトーシスに関与するJ鎖遺伝子の発現が高いことが判明した。そこで、European Mouse Mutant Archive (EMMA)で作製・保存されていたJ遺伝子座のイントロン１にスプライスアクセプターとEGFPとCreERT2がノックインされた変異アレルを導入し、不要なピュロマイシン耐性遺伝子発現カセットをDre-rox組換えで除去したのち、マウスに戻し、J chain-EGFP-CreERT2レポーターシステムを構築した。本レポーターシステムを用いて、成体における脾臓B細胞におけるJ鎖遺伝子の発現について解析した結果、CD19+CD5+~lowB220low~-CD138-のB-1細胞中にEGFP陽性の細胞集団が少数存在することが判明した。本細胞集団はBAFF-Rと同一分子ファミリーに属するTACIの発現がEGFP陰性の細胞集団より高く、tdTomato陽性の胎児に由来する脾臓B-1細胞と同様の表現型を示すことから、胎児由来B-1細胞集団に該当するものと想定された。今後、Ig-seqを用いて胎児期に発生したB細胞とのレパトアの重複について解析する予定である。
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