| 研究課題/領域番号 |
21H02374
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| 研究機関 | 日本獣医生命科学大学 |
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研究代表者 |
田中 良和 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (50291159)
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| 研究分担者 |
落合 和彦 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (30550488)
小熊 圭祐 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (50436804)
佐々木 崇 札幌医科大学, 医学部, 講師 (50723897)
古谷 哲也 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (60647676)
手嶋 隆洋 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (80610708)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ウイルス複製 / 猫伝染性腹膜炎 / コロナウイルス / カルシウム拮抗薬 / 抗ウイルス薬 / カルシウムイオンチャンネル |
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| 研究実績の概要 |
ネココロナウイルス（FCoV）の強毒株（FIPV）感染によって起こる猫伝染性腹膜炎（FIP）は致死率の高い感染症である。このため、国内外において、FIPに対し様々なワクチンや抗ウイルス薬の開発研究が行われてきたが、承認薬で著効を示すものはなかった。FIPVはマクロファージに吸着後、エンドソーム内で分解されずに脱殻し、ウイルス増殖するのが特徴である。エンドソーム内の分解酵素がpH依存性に作用するため、申請者はカルシウム（Ca）イオンがpHを制御することに着目し、Ca拮抗薬のFIPV複製阻害効果を検証した。
前年度の実験結果からエンドソーム内の水素イオン濃度(pH)やCaイオン濃度がウイルス複製に重要であることが明らかとなったので、今年度はエンドソーム内のpHやCaイオン濃度に影響を及ぼすCa拮抗薬以外の薬剤でウイルス複製阻害効果のある薬剤をスクリーニングした。この解析においてCaイオンに特異的に結合する蛍光物質やpHにより蛍光波長が変化する薬剤を利用し、共焦点レーザー顕微鏡解析後、ImageJ-Fiji解析ソフトにて定量系を確立した。その結果、Ca拮抗薬以外で数種類のイオノフォア抗生物質やフォスファジルイノシトール代謝系を制御している細胞内因子を同定した。さらにエンドソーム特異的に発現するイオンチャンネルの同定ができた。特にイオノフォア抗生剤は0.1マイクロモルで、ウイルス複製をほぼ阻害する効果が認められた。これらのイオノフォア抗生剤は家畜の飼料に配合され、残留もほぼ無いことや最近、猫の肉腫治療に用いられている現状から将来、臨床応用が可能である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度の実験結果からエンドソーム内の水素イオン濃度(pH)やCaイオン濃度がウイルス複製に重要であることを報告した。今年度の進捗としてエンドソーム内のpHやCaイオン濃度に影響を及ぼすCa拮抗薬以外の薬剤でウイルス複製阻害効果のある薬剤をスクリーニングした。その結果、Ca拮抗薬以外のイオノフォア抗生物質やフォスファジルイノシトール代謝系を制御している細胞内因子を同定した。さらにエンドソーム特異的に発現するイオンチャンネルの同定ができた。
次いでそれらの薬剤の細胞内ターゲット蛋白をコードする遺伝子をCRISPR-Cas9系によりノックアウトし、ノックアウト細胞を樹立するとともにFIPV複製効率を生化学的およびウイルス学的解析した。
上述の研究を遂行できたことから概ね順調に研究が進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度に続き、エンドソーム内のCa濃度やpHに影響を及ぼす薬剤の標的蛋白の同定を行う。
また、阻害剤がFIPVの増殖を抑える現象がエンドソーム内で行われるのかを検証する。CoVはDMVs内でゲノム複製，または転写・翻訳する．この構造物は電子顕微鏡下で容易に観察でき，DMVs形成阻害が起こるとその数・サイズ・形態に変化が生じる．このため，各Ca拮抗薬によるDMVsの構造変化とFIPVの細胞局在をクライオ電子顕微鏡で解析・評価する．
さらに引き続きFIPV複製阻害効果のあった細胞側因子のクローニングとその生理学的作用を調べ、各シグナルカスケード上にある蛋白を標的とする阻害剤のFIPV複製における効果を検証する。
次いで、各標的蛋白の当該遺伝子をノックアウトし細胞の樹立を行う。これらの細胞に関し、FIPVの複製阻害効果を解析し、Ca拮抗薬やその他のイオンチャンネルがどのようにウイルス複製阻害機構に関与するか解析する。
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