| 研究課題/領域番号 |
21H02420
|
|---|
| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
|---|
研究代表者 |
柴田 直樹 兵庫県立大学, 理学研究科, 准教授 (30295753)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | 構造生物学 / 結晶構造解析 / Wntシグナル伝達経路 / 癌 |
|---|
| 研究実績の概要 |
R3年度は，① CKAP4-DKK複合体の構造解析，② CKAP4細胞外領域全体の構造解析，③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析，④ CKAP4-抗体フラグメント相互作用解析，について研究を遂行した。以下にこれまでの結果について概要を示す。
① CKAP4とDKK1 cysteine rich domain (DKK1_CRD1)試料をそれぞれ別々に調製したものを混合し，ゲルろ過クロマトグラフィーを行ったが，複合体試料を得ることはできなかった。一方，CKAP4-DKK1_CRD1融合タンパク質の大腸菌発現系を構築し，巻き戻し法による試料調製を行った。得られた融合タンパク質について結晶化実験を行った。
② CKAP4細胞外領域（128-602）のうち，構造未知の領域について主鎖の大部分と側鎖の一部についてX線結晶構造解析に成功した。これによって，高次構造も含めてCKAP4細胞外領域全体の全貌が明らかになった。
③ ４種類の抗CKAP4モノクローナル抗体（mAb1-4）のうち，mAb1についてCKAP4との複合体のX線結晶構造解析が完了した。mAb2およびmAb3についてはCKAP4との複合体として高純度の試料調製に成功し，結晶化実験を行った。
④ QCM装置を用いてmAb1とCKAP4の相互作用解析を行った。mAb1をセンサーチップに固定し，CKAP4(465-602)を逐次的に反応槽にインジェクトした。CKAP4(465-602)の濃度が低い(< 10 nM)領域では振動数変化の再現性が悪かったため，正確な解離定数を得ることができなかったが，5-10 nMの範囲内にあると見積もられた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①～④の各項目について，現時点における研究全体に対する達成度は以下の通りである。
① CKAP4-DKK複合体の構造解析（30%）
② CKAP4細胞外領域全体の構造解明（80%）
③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析 (30%)
④ CKAP4-抗体フラグメント相互作用解析（20%）
以上を総合すると40%まで到達しており，全体的には概ね計画通りに進行していると判断できる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
①～④の各項目について，研究の進捗状況をふまえ，以下の方針で研究を進めていく。
①現時点でCKAP4-DKK1_CRD1融合タンパク質については結晶が得られていない。CryoEMによる単粒子解析を視野に入れ，DKK1_CRD1よりも分子量が大きいDKK3_CRD1-CRD2を用いて試料調製を行う。
②CKAP4細胞外領域の構造解析はほぼ完了したが，まだ側鎖の構造が不明な領域があるため，引き続き結晶化条件の改良に取り組む。
③mAb2-CKAP4，mAb3- CKAP4複合体については現時点で結晶が得られていないため，CryoEMによる単粒子解析を並行して行う。
④CKAP4(465-602)は10 nM以下では四次構造が壊れるためにmAb1と相互作用しなくなる可能性が考えられる。CKAP4細胞外領域は短い断片になると単量体になりやすくなるため，CKAP4細胞外領域全体または465-602よりも長い断片を用いて測定を行う。また，他の抗体についても解離定数の見積もりを行う。
|
