| 研究課題/領域番号 |
21H02422
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
舘林 和夫 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (50272498)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | リン酸化 / 高浸透圧 / 出芽酵母 / シグナル伝達 / MAPキナーゼ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、酵母の高浸透圧応答性Hog1 MAPK経路で見出した高浸透圧による細胞質局在キナーゼのリン酸化増強作用の仕組みの解析を行なった。リン酸化増強の作用点として（1）Pbs2 MAP2K-Hog1 MAPK反応過程、（2） Ssk2 MAP3K-Pbs2 MAP2K反応過程の２つが存在する。特に（2）のリン酸化増強については仕組みが全く不明であるため、（2）に焦点を当てて解析した。まず、高浸透圧応答に必須な上流のSln1センサーの破壊株などを使った分子遺伝学的、生化学的解析から、このリン酸化反応過程が実際に高浸透圧増強を受けることを示した。またこの反応増強にSsk2と結合するレスポンスレギュレーターSsk1の特定の領域が必要なこともわかった。（2）の反応増強はPbs2のリン酸化を指標にしているため、現時点では高浸透圧により、Ssk2の活性が増強しているのか、Pbs2がリン酸化を受けやすくなっているのかがわからない。そこで、Ssk2の制御領域への系統的欠失変異の導入、Pbs2のランダム変異導入によって、高浸透圧によるリン酸化増強を模倣した変異体の単離を試みた。その結果、Ssk2、Pbs2両者で高浸透圧なしでも恒常的にHog1経路を活性化する変異体の取得に成功した。
高浸透圧によるPbs2リン酸化増強の理由として、リン酸化が高浸透圧で増強される可能性に加え、Pbs2の脱リン酸化が高浸透圧によって抑制される可能性も考えられる（Pbs2のリン酸化レベルはどちらの場合も上がる）。そこでPbs2の脱リン酸化に関わるホスファターゼを探索し、Ptc1を責任ホスファターゼの一つとして同定した。
以上より、（2）のリン酸化増強の仕組みの解明に向けて、本年度の研究で複数の手がかりを得ることができたと考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
実績概要で示したように、仕組みが全く不明である、高浸透圧によるSsk2 MAP3K-Pbs2 MAP2K反応過程の増強について、実際に増強が起きていることを実証するとともに、その仕組みを明らかにするための、恒常活性型変異体の取得、Pbs2の脱リン酸化に働くホスファターゼの同定に成功した。これらは、高浸透圧によるリン酸化増強の仕組みを明らかにするための大きな手がかりとなり得ることから、研究は予定どおり進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の知見をもとに、リン酸化反応の中核を担うPbs2、Ssk2に焦点を当て、高浸透圧によるキナーゼ反応増強における役割、仕組みを検討する。
Pbs2のリン酸化反応増強への関与について、まず本年度単離したPbs2の恒常活性型変異体の解析が研究の柱になる。Pbs2は上記反応過程の (1)ではキナーゼ酵素として、(2)ではキナーゼの基質として働く。高浸透圧が直接的または間接的にPbs2に働き、酵素あるいは基質としての性質を変化させることでリン酸化増強に関わる可能性は高い。そこで単離した高浸透圧刺激なしでもHog1経路を活性化するPbs2変異体について、各リン酸化反応における酵素、基質としての性質変化、Hog1経路の他因子との相互作用の変化などを、分子生物学、生化学、細胞生物学のアプローチにより解析する。また、変異体のNMR解析など構造生物学的アプローチによっても、Pbs2のリン酸化増強反応への関与を検討する。
またSsk2についてもその制御領域の特定の欠失変異が恒常的にPbs2をリン酸化することを見出しており、同様のアプローチで解析する。
さらにPbs2の脱リン酸化に関わるホスファターゼとしてPtc1を同定しており、Pbs2の脱リン酸化と高浸透圧刺激との関係性についてPtc1を中心に明らかにする。
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