| 研究課題/領域番号 |
21H02439
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
南後 恵理子 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (90376947)
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| 研究分担者 |
保坂 俊彰 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 技師 (40462725)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | X線自由電子レーザー / ロドプシン |
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| 研究実績の概要 |
微生物由来のレチナールタンパク質（ロドプシン）は、光を受容して機能を発揮する膜タンパク質であり、最近ではその光応答性を利用して細胞の光制御を可能とするオプトジェネティクスに利用されるなど応用面でも注目されている。ロドプシンの最も代表的な機能は、イオンを能動輸送する機能であり、プロトンポンプのバクテリオロドプシン、クロライドイオンを輸送するハロロドプシン、ナトリウムポンプのKR2などが知られている。これらのイオンポンプ機能を持つロドプシンを比較すると、その基本構造は類似しており、構造の類似性にも関わらず電荷の異なるイオンを同一方向に輸送する仕組みに興味が持たれている。 今までに、様々なイオンポンプロドプシンが発見されており、それらのロドプシンにおいて、部位特異的変異導入及びその活性測定やクライオトラップ法による中間体X線結晶構造解析などが行われてきたが、イオンの選択性やイオン輸送機構の全容は明らかではない。本課題では、光反応の過程をリアルタイム且つ原子レベルで可視化することを目指して、X線自由電子レーザー（XFEL）を用いた時分割実験を実施する。高い空間分解能の動的構造情報を得るには、XFELによるシリアルフェムト秒結晶構造解析が用いられており、微結晶を調製する必要がある。昨年度までに得られた微生物由来のイオンポンプロドプシンの発現系を用いて、大量発現並びに精製を行った。続いて結晶化スクリーニングを行ったところ、4Åのデータではあったが回折像を取得した。現在、高分解能の回折データを得るべく検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ロドプシン類はモノオレインなどの脂質を用いる結晶化法であるLipidic cubic phase（LCP）で良好な結晶が得られやすいことが知られており、本課題でも各種クロライドポンプロドプシンのLCPによる結晶化スクリーニングを実施した。LCPによる結晶化の利点は、高い空間分解能データが得られやすいこと、LCPで用いられる高粘稠の脂質がシリアルフェムト秒結晶構造解析（SFX）における試料輸送媒体として用いることができる点である。SFX実験では高密度結晶を数mLスケールで調製する必要があること、反応を追跡する点で高い空間分解能が求められるため、多くの結晶化スクリーニングを行った。その結果、2種のクロライドポンプロドプシンで回折データを収集することができた。いずれも分解能やtwinningの点で構造解析に適しておらず、現在更なる精製方法の改善、結晶化を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度においては、放射光施設またはXFEL施設にて測定を行う予定である。時分割実験でデータが得られ次第、データ処理並びに動的構造解析を行う。また、その動的構造情報を元に変異体の作成やキメラタンパク質の設計などを行い、イオン輸送機構の詳細について明らかにしていく。
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