| 研究課題/領域番号 |
21H02443
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
今田 勝巳 大阪大学, 大学院理学研究科, 教授 (40346143)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 細菌べん毛 / クライオ電子顕微鏡 / X線結晶構造 / シンメトリーミスマッチ / 超分子複合体 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、細菌べん毛軸構造形成中間体と短繊維べん毛の構造をクライオ電子顕微鏡によりロッド-フック結合部、フック-フィラメント結合部の構造と、各部の成長端の構造を解明し、物性・機能・構造・シンメトリーが異なる領域を結合して巨大な軸構造が一体で作動するしくみとシンメトリーミスマッチを克服・利用して複雑な構造を形成するしくみの解明を目指している。今年度の実績は以下の通りである。
１）フィラメント欠損変異体からジャンクション中間体べん毛を単離精製し、クライオ電子顕微鏡像の単粒子解析を行った。前年度までに得た4 A分解能密度図はキャップに不鮮明な場所があったため、再度解析をやり直した結果4.44 Aでの解析に成功した。その結果、ジャンクション上の5量体キャップの段差の位置がフィラメント上の5量体キャップの段差の位置と異なること、キャップの末端の形態もフィラメント上とジャンクション上で異なることが明らかになった。
２）FlgK蛋白質欠損変異体を用い、FlgDキャップが結合した状態で成長が停止したべん毛試料を単離精製し、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を行った。その結果、FlgDキャップ-フック結合部の5.5 A分解能密度図の作成に成功し、FlgDキャップの結晶構造とフックの電子顕微鏡構造を当てはめてモデルを構築した。その結果、FliDキャップとは全く異なる結合の仕方をすることが明らかになった。一方で、分解能が十分ではないため、高分解能構造を目指して、クライオ電子顕微鏡による撮影を継続した。
３）べん毛MotA複合体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、3.4 Aでの解析に成功した。MotAのみでも固定子複合体と同様の複合体を形成することを証明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度までにフラジェリンの発現を制御できる変異体を用から精製した短繊維べん毛試料のクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、FliDの結晶構造とフィラメントのクライオ電子顕微鏡構造を合わせることで、FliDキャップ-R型フィラメント結合部の構造を8 A分解能で解明した。また、フィラメント欠損変異体からジャンクション中間体べん毛を単離精製してクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、FliDキャップ-ジャンクション結合部の約4 A分解能の密度図を得た。さらに、FlgK蛋白質欠損変異体からFlgDフック中間体べん毛を単離精製し、クライオ電子顕微鏡による撮影を開始した。2022年度は、ジャンクション中間体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析をやり直すことで不鮮明な箇所のない密度図の作成に成功し、FliDキャップ-ジャンクション結合部の構造を4.44 A分解能で解明した。また、FlgK蛋白質欠損変異体から精製したべん毛試料のクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、FlgDキャップの結晶構造とフックのクライオ電子顕微鏡構造を合わせることでFlgDキャップ-フック結合部の5.5 A分解能での解析に成功した。しかし、モデルに曖昧な場所が残っているため、クライオ電子顕微鏡による撮影を継続し、高分解能での解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は以下の項目を進める。
１）FlgDキャップが結合した状態で成長が停止したべん毛試料のクライオ電子顕微鏡撮影を継続し、FlgDキャップ-フック結合部の高分解能構造を解明する。そして、FliDキャップ-フィラメント結合部の構造と比較し、成長端の共通点と相違点を解明する。
２）短繊維試料の作成条件を改良してクライオ電子顕微鏡撮影を継続し、FliDキャップ-フィラメント結合部の高分解能化とフック-ジャンクション-フィラメント結合部の解析を実施する。
３）FlgJキャップが結合した状態で成長が停止したべん毛試料の作成とクライオ電子顕微鏡撮影を実施し、ロッド中間体の実態を解明する。
４）タグを用いて強アルカリ処理を用いない精製法を確立し、各成長中間体の精製に用いる。
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