電気信号を化学信号に変える電位依存性ホスファターゼVSPの動作機構の解明

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H02444
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 中川 敦史 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20188890)
• 研究分担者: 岡村 康司 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (80201987) ; 米澤 康滋 近畿大学, 先端技術総合研究所, 教授 (40248753)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 膜電位 / タンパク質 / 構造生物学

研究実績の概要

電位依存性ホスファターゼVSPは、膜電位という電気信号を酵素活性の制御という化学信号に変える膜タンパク質であり、生物における電気信号の新たな役割を示す重要な分子である。本研究では、VSPの様々な状態の詳細な原子構造を解明し、VSPが電気信号を化学信号に変える動作機構の理解を目指すとともに、電気生理実験や蛍光アミノ酸ANAPを利用した実験により、細胞内の動きを追うことを試みた。
構造解析については、野生型VSPに加え、酵素活性をなくしたC302S変異体を対象として加えて研究を進めた。また、これと並行してＮ末端領域を削除した変異体、およびＮ末端およびC末端それぞれに我々が開発した結晶化タグ（Gnb-tag）を付加した変異体についても発現・精製条件の決定を進めた。様々な界面活性剤をスクリーニングした結果、動的光散乱（DLS）で単分散性を示し、ゲルろ過、SDS-PAGEで結晶化に供すことのできる純度であることが確認できる試料調製条件検討を行った。
結晶化と並行して、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して、Gnb-tagに結合するGFP変異体との複合体の調製を行った。様々なVSP変異体やGFP変異体の組み合わせで負染色電子顕微鏡観察を行ったところ、試料が単量体として存在し、期待される3つのドメインが観察できるコンストラクトを得たので、クライオ電子顕微鏡による試料観察を行った。２次元平均化とクラス分けの結果は、細胞質ドメインもしくはタグ、あるいはその両方が揺らいでおり、VSPの膜部分をうまく平均化した像を得ることができなかった。上記の試料について結晶化を試みたが結晶を得ることはできなかった。
さらに、電気生理学、蛍光光度法、構造モデリングを組み合わせたアプローチにより、S4の最下部にある2つの疎水性残基が、VSD-CCRカップリングの後期遷移において重要な役割を果たしていることを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

電位依存性ホスファターゼ（VSP）の動作機構の解明のため、静止状態の構造解析を目指して、様々なコンストラクト・変異体の探索、発現・精製条件の最適化、界面活性剤のスクリーニングを進めた。様々な界面活性剤をスクリーニングし、動的光散乱（DLS）で単分散を示し、ゲルろ過、SDS-PAGEで結晶化に供すことのできる純度であることが確認できる試料調製条件を決定し、構造解析を進めた。
構造解析と平行して、電気生理学、蛍光測定、構造モデリングを組み合わせたアプローチにより、膜電位変化が酵素活性に与える影響について調べたところ、電位センサードメイン上のS4の最下流にある2つの疎水性残基が、電位センサードメイン（VSD）と細胞質酵素領域（CCR）のカップリングに重要な役割を果たすことを見いだし、論文発表を行った。

今後の研究の推進方策

これまでの研究で、様々な変異体・結晶化タグを利用した構造解析のための複合体形成条件の検討などを行い、構造解析に供する試料調製条件を確立した。この条件を元にＸ線結晶解析、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、構造解析を目指す。さらに、計算科学、電気生理学等と組み合わせて、その機能解明を目指す。

研究成果

• [雑誌論文] Interaction between S4 and the phosphatase domain mediates electrochemical coupling in voltage-sensing phosphatase (VSP) (2022)
  • 著者名/発表者名: Mizutani Natsuki、Kawanabe Akira、Jinno Yuka、Narita Hirotaka、Yonezawa Tomoko、Nakagawa Atsushi、Okamura Yasushi
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences USA 巻: 119 ページ: e2200364119
  • DOI: 10.1073/pnas.2200364119
  • 査読あり
• [雑誌論文] Insight into the function of a unique voltage-sensor protein (TMEM266) and its short form in mouse cerebellum (2022)
  • 著者名/発表者名: T. Kawai, H. Narita, K. Konno, S. Akter, R. T. Andriani, H. Iwasaki, S. Nishikawa, N. Yokoi, Y. Fukata, M. Fukata, P. Wiriyasermkul, P. Kongpracha, S. Nagamori, K. Takao, T. Miyakawa, M. Abe, K. Sakimura, M. Watanabe, A. Nakagawa, Y. Okamura
  • 雑誌名: Biochemical Journal 巻: 479 ページ: 1127～1145
  • DOI: 10.1042/BCJ20220033
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Structural studies of voltage-sensing phosphatase (2023)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Nakagawa
  • 学会等名: International Symposium on Structure and Folding of Disease Related Proteins
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural studies of voltage-sensing phosphatase (2022)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Nakagawa
  • 学会等名: The 17 th conference of Asian Crystallography Association (AsCA2022)
  • 国際学会 / 招待講演