|
PomBは二次構造を取らない天然変性領域を持ち、構造が大きく揺らいでいると考えられている。天然変性領域の揺らぎは金ナノ粒子プローブを用いた１分子回転計測の障害となると予想される。そこで、当該領域を削ったΔ71-150変異体を新たに作製した。精製したΔ71-150変異体のI50C残基を蛍光色素Cy3マレイミドで標識して１分子蛍光観察を行い、PomAのC末にリンカーを介して導入したHis10タグとNi-NTA修飾したガラス基板の相互作用により、濃度依存的に特異的に結合することを確認した。また、精製したPomAB複合体試料のPomAとPomBの化学量論比の改善を目的として、PomBのC末にはStrepTagIIがこれまでに導入されている。そこで、金ナノ粒子の表面をストレプタクチンで修飾することで、このStrepTagIIに特異的に結合させることを試みた。しかしながら、現時点では明確な特異的結合が見られていない。現在、StrepTagIIをタンデムに２つ繋ぐことで改善を試みている。
さらに、精製したPomAB複合体を脂質二重膜小胞（リポソーム）に再構成し、Na+輸送活性の測定を試みた。Na+の蛍光性指示薬であるSoduim GreenをPomAB再構成リポソームに内包させ、外部溶液にNa+を加えることで蛍光強度の増加を蛍光分光光度計で計測した。しかしながらこれまでのところ、明確かつ有意な蛍光強度の増加は確認されていない。現在、PomAB複合体のリポソームへの再構成法（凍結融解法、透析法、バイオビーズ法）や内包させるSoduim Green の濃度等、実験条件の改善を試みている。また、Na+輸送性のV-ATPaseもコントロール実験の試料として用い実験を進めている。
|
