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前年度に引き続き、チロシンキナーゼの基質を大規模に同定するため、酸化金属クロマトグラフィーと配位子交換クロマトグラフィーを併用したチロシンリン酸化ペプチド濃縮法の開発、最適化を行った。ペプチド上のリン酸基の位置の違いにより溶出プロファイルが異なることが示された。溶出溶液を段階的に変えて分画を行うことにより、チロシンリン酸化ペプチドの同定数が向上した。また、存在量の低いリン酸化チロシンサイトを同定できることもわかり、リン酸化チロシン解析の高深度化に成功した。
高深度リン酸化プロテオミクスを用いて、キナーゼのin vitro基質の再同定を実施した。得られた情報をもとに人工基質配列の再設計を行った。最適な基質配列決定を行う際の候補ペプチドの選出方法および使用するデータセットを評価した結果、既存の基質ペプチドよりも選択性の高い基質ペプチドをデザインできる可能性が示された。さらに選択性を向上させるために、MAPKに属するいくつかのキナーゼについて、docking motifを含むペプチドと基質配列を連結させたペプチドを設計、合成した。現在、キナーゼ組換え体を用いたin vitro反応試験により、選択性評価実験を進めている。
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のアイソフォームを区別することが可能な超高選択的基質ペプチド創出を目的として、アイソフォームのin vitro基質の高深度同定、および安定同位体標識による定量解析を行い、特定のアイソフォームのみに選択的にリン酸化されるペプチド配列を同定した。また、アイソフォーム選択的基質モデルをposition weight matrixとして抽出し、人工基質ペプチドを設計した。実際に合成ペプチドを用いて選択性の評価を行った結果、ヒトプロテオーム内に存在するペプチドの方が高いアイソフォーム選択性を示すことが明らかになった。
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