パラログ遺伝子サブ機能化進化仮説のエンハンサー移植実験による検証

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H02543
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 隅山 健太 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00370114)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: エンハンサー / 進化 / Dlx遺伝子 / パラログ遺伝子

研究実績の概要

2022年度はDlx3-4遺伝子クラスターおよびDlx5-6遺伝子クラスターの構造の類似性に注目し、CTCFによる長距離ゲノム領域間でのループ形成などによって物理的にプロモーターと近くなる領域のクラスター間での構造的類似性および鰓弓でのエンハンサー活性の強さから、Dlx3-4遺伝子クラスターではTAD3鰓弓エンハンサー、Dlx5-6遺伝子クラスターでは新規の鰓弓のエンハンサーをそれぞれターゲットとして選定し、エンハンサーノックアウトマウスをCRISPR/Cas9で作製し系統化した。このマウスを用いて、正確にエンハンサー欠失の発現量変化を定量できるAccu-cis法を用いてRNA-seq結果から鰓弓発現に及ぼすその影響を評価した。Dlx56鰓弓エンハンサー欠失マウスでは下顎が上顎化する顕著な表現型が観察された。このマウスの表現型をパラログ活性化でレスキューすることが可能かどうかを確認するため、Dlx56鰓弓エンハンサーをDlx3-4遺伝子クラスターにノックインしたマウスを作成し、交配によりその解析を進めているところである。また、Dlx3-4遺伝子の鋤鼻器エンハンサーをクラスターとして欠失することで効率よく鋤鼻器組織特異的なノックダウンを実現できることが示され、新たな条件付きノックアウトマウス作成の方法論へとつながる成果となった。特に、通常ノックアウトで致死的な表現型を示す遺伝子の場合に、この方法により致死性を回避しつつ特定器官での遺伝子機能解析が可能になる新たな実験系として期待し検証を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

実験に必要な各種エンハンサー欠失マウスは順調に準備が進んでいる。Accu-cis法のために必要な人工的にDlx遺伝子コード領域にSNPを導入したマウスの準備もDlx34に加え新たにDlx56でクラスターで完了しており、現在順次エンハンサー欠失マウスの発現量変化の定量測定を進めているところである。エンハンサー欠失により、効果的に条件付き遺伝子ノックアウト状態を作出できることを示すことができた。さらにエンハンサーノックインマウスの樹立に成功し、その解析を進めている。以上計画に沿って順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

効率を高めるためさらに迅速なノックアウトマウス作製・表現型評価方法の開発を進める必要がある。また今回のDlx56pエンハンサー欠損マウスで影響が出る細胞群以外のDlx5－6発現細胞の混入が定量解析の問題となることから、鰓弓組織のバルク解析だけでなく1細胞解析手法を取り入れるなどして特定細胞群で起きている顕著な変化を的確に捉える工夫を行いたい。エンハンサー機能の検証のため、交配によりエンハンサー欠失マウスをパラログ遺伝子活性化によりレスキューできるかを確認する実験を進めている。これまでにDlx5-6遺伝子クラスターでの鰓弓発現に最も大きな影響を与えるエンハンサーを特定できたことで、その配列モチーフ解析により上流因子候補の推定ができたので、今後その解析実験を進めていく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Generation of transgenic mice expressing a FRET biosensor, SMART, that responds to necroptosis (2022)
  • 著者名/発表者名: Murai Shin、Takakura Kanako、Sumiyama Kenta、Moriwaki Kenta、Terai Kenta、Komazawa-Sakon Sachiko、Seki Takao、Yamaguchi Yoshifumi、Mikami Tetuo、Araki Kimi、Ohmuraya Masaki、Matsuda Michiyuki、Nakano Hiroyasu
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 5 ページ: 1331
  • DOI: 10.1038/s42003-022-04300-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Distinct phosphorylation states of mammalian CaMKIIβ control the induction and maintenance of sleep (2022)
  • 著者名/発表者名: Daisuke Tone, Koji L. Ode, Qianhui Zhang, Hiroshi Fujishima, Rikuhiro G. Yamada, Yoshiki Nagashima, Katsuhiko Matsumoto, Zhiqing Wen, Shota Y. Yoshida, Tomoki T. Mitani, Yuki Arisato, Rei-ichiro Ohno, Maki Ukai-Tadenuma, Junko Yoshida Garcon, Mari Kaneko, Shoi Shi, Hideki Ukai, Kazunari Miyamichi, Kenta Sumiyama et al.
  • 雑誌名: PLOS Biology 巻: 20 ページ: e3001813
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.3001813
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Conditional gene knockout by enhancer cluster elimination in the Dlx3-4 bigene system (2023)
  • 著者名/発表者名: Akira Tanave, Kenta Sumiyama
  • 学会等名: 36th International Mammalian Genome Conference (IMGC2023)
  • 国際学会
• [学会発表] 筋細胞の融合にかかわる内在性レトロウイルス由来の新規遺伝子 (2022)
  • 著者名/発表者名: 上田真保子, 小野悠介, 隅山健太, 三橋里美, 三橋弘明, 中川草
  • 学会等名: 日本進化学会大会第24回沼津大会
• [学会発表] 哺乳類Dlx5-6遺伝子クラスターの転写制御機構と進化 (2022)
  • 著者名/発表者名: 隅山健太、田邉彰
  • 学会等名: 日本進化学会大会第24回沼津大会