| 研究課題/領域番号 |
21H02682
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
瀬川 勝盛 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (20542971)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 細胞膜 / 小胞体 / リン脂質 / フリッパーゼ / 非対称性 |
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| 研究実績の概要 |
フリッパーゼであるATP8A1とATP11BをATP11A-ATP11C二重欠損細胞の遺伝背景において欠損させ(四重欠損細胞)、定常状態で細胞膜のPSが露出するかを確認した。その結果、既知のPSフリッパーゼをすべて失ったフリッパーゼ四重欠損細胞は、依然として細胞膜のPSの非対称分布を樹立することが明らかとなった。本年度では、この四重フリッパーゼ欠損細胞株を用いて、Genome-wide CRISPR/Cas9法を用いた機能スクリーニングを行った。具体的に、四重欠損細胞に、約21000の遺伝子を標的にしたCRISPR/Cas9 sgRNAライブラリーを組み込んだウイルスを感染させ、各種遺伝子を破壊する。次いで、定常状態においてPSの非対称性が崩壊し、PSを表面に露出した変異細胞をセルソーターで分取し、どの遺伝子が欠損しているかを明らかにした。四重フリッパーゼ欠損細胞を用いた上述のスクリーニングの結果、候補分子の同定に成功した。また、フロッパーゼの同定についても、候補分子の同定に成功した。この分子を欠損させると、細胞膜リン脂質の組成が変化することを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
フリッパーゼ四重フリッパーゼ欠損細胞を用いたノンバイアススクリーニングの結果、細胞膜ホスファチジルセリンの非対称分布に関与する分子の同定に成功した。また、フロッパーゼの候補分子の同定にも成功した。概ね順調に進んでいると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
同定した分子の機能解析を行う。具体的には、同定した分子にGFPを融合させ、細胞内の局在を明らかにする。同定遺伝子の欠損細胞におけるホスファチジルセリンやホスファチジルコリンの分布を明らかにする。同定した分子をHEK293細胞に発現・精製し、分子がどのような複合体を形成しているのかを明らかにする。最終的に、精製した複合体のリン脂質移層活性を検出することを目標とする。
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