|
先行研究より、胚中心で表面ＢＣＲ発現量の高いＢ細胞が記憶Ｂ細胞に分化しやすい可能性が示唆された。胚中心Ｂ細胞におけるＢＣＲ発現量の違いが記憶Ｂ細胞分化に寄与するのか、その因果関係の証明のため、表面発現量および抗原親和性の定量化を可能とする実験系の構築を継続した。ＮＰハプテン特異的胚中心明領域Ｂ細胞と、記憶Ｂ前駆細胞シングルセルより取得したＢＣＲ遺伝子をクローニングしてリコンビナント抗体を作製し、抗原親和性を測定した。測定結果に基づき、親和性が同程度であるが細胞表面発現量の異なるＢＣＲ配列を１０クローン選択した。このＢＣＲ配列をマウスprimary B細胞にノックインするため、その実験系の構築を行った。
検討の結果、マウスＢ細胞の免疫グロブリン遺伝子座にＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９を用いて内在性のＩｇｈ遺伝子を切断し、選択したＢＣＲ配列断片の導入・相同組換えによって、内在性Ｉｇｈ遺伝子座に外来性ＢＣＲ配列をノックインする実験系の構築に成功した。
当初のノックイン効率は0.3％ほどであったことから、次に実験条件の改良を試みた。細胞培養条件、遺伝子導入試薬、導入遺伝子断片の改変により、ノックイン効率を1～2％まで向上させることに成功した。
このノックインＢ細胞におけるＢＣＲの発現量を解析したところ、マウス生体内で胚中心あるいは記憶Ｂ細胞として発現していたときの表面ＢＣＲ量を正しく反映していることが確認できた。
|
