| 研究課題/領域番号 |
21H02943
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
新熊 悟 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (00613788)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 表皮水疱症 / 復帰変異モザイク / 相同組換え |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、表皮細胞の増殖優位性を獲得する機序を解明するため、遺伝子編集技術を応用した復帰変異モザイクを有する表皮水疱症モデルマウスを世界で初めて作製し、①増殖優位性を有する表皮幹細胞の同定や②上皮-間葉転換の役割を明らかにする。復帰変異モザイクは体細胞分裂時の相同組換えによって生じるため、複合ヘテロ接合型遺伝子変異を有するマウスを作製する必要がある。Col17遺伝子のexon2とexon3にフレームシフト変異を導入したマウスをそれぞれ作製し、これらのマウスを交配することで、それぞれのアリルのexon2とexon3にフレームシフト変異を有する複合ヘテロCol17欠損マウスの作製に成功した。複合ヘテロCol17欠損マウスの培養表皮細胞に対して、CRISPR/Cas9発現AAVベクターを用いてexon2とexon3の間で遺伝子切断したところ、一部の細胞でCol17発現量の増加が確認でき、復帰変異モザイクを誘導できた。さらにCol17を発現する表皮角化細胞を抽出し、次世代シーケンス（Pacvio）を行ったところ、一部の細胞において相同組換えが生じていることが同定できた。
また、このAAVベクターを複合ヘテロCol17欠損マウスに遺伝子導入し、生体内で復帰変異モザイクを誘導させ、復帰変異モザイクの有無について免疫組織学的解析を用いて解析をおこなったところ、一部において、復帰変異モザイクが生体内で生じていることが証明できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
複合ヘテロCol17欠損マウスから初代培養した培養細胞およびモデルマウスの生体内で復帰変異モザイクの誘導に成功しており、本研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、Col17を発現する表皮角化細胞を抽出し、次世代シーケンス（Pacvio）を行い、一部の細胞において相同組換えが生じていることが証明できた。今後は、このデータを解析し、具体的にどれくらいの頻度で相同組換えが生じているのか、さらなる解析を行う。
また、複合ヘテロCol17欠損マウスとR26R-Confettiマウスを交配し、細胞系譜解析が可能な復帰変異モザイクモデルマウスを作製する。
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