転写因子Scleraxisによって制御される筋骨格システムの統合的理解

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H03107
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 宿南 知佐 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (60303905)
• 研究分担者: 隅山 健太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00370114) ; 樋口 真之輔 神戸大学, 附属学校部, 附属中等教育学校教諭 (20847131) ; 吉本 由紀 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40735304)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 腱・靱帯 / Scleraxis / エンハンサー / 遺伝子改変動物 / enChIP / Sox9

研究実績の概要

Scx遺伝子の下流に同定した1.97 kbのenhancer領域を、さらに分割し、ゲノム領域をhsp68のminimal promoterとTol2配列を有するLacZ reporterベクターに組み込んたベクターを受精卵にmicroinjectionし、得られたTgマウス胚のLacZ活性をX-gal染色によって解析した。その結果、343 bpのゲノム断片にenhancer活性が検出され、哺乳類、鳥類、シーラカンスまで高度に保存されているモチーフが存在することを見出した。このゲノム領域をpGL4.23に組み込み、enhancer領域に結合する候補となる転写因子の発現ベクターと共に、HEK293T細胞、ATDC5細胞、腱細胞に導入し、Dual luciferase assayを行った。また、昨年度に引き続き、enChIPによる解析も進めている。系譜解析では、ScxCre/+:RosaTomatoマウスを用いた解析によって、２週齢の脛骨では、Scxの発現履歴がある細胞は、付着している腱や靱帯に限局しているが、６週齢になると、皮質骨や一次海綿骨の一部の骨芽細胞でも観察されることを見出している。免疫染色を行うと、それらの細胞では、Runx2の発現が検出された。ScxCreERT2;RosaTomatoマウスに、肋骨でのScxの発現が検出される胎生11.5日より後に4-ヒドロキシタモキシフェンを投与して、Tomatoの発現を観察したところ、肋骨でのCreの発現を回避することが出来ることが確認出来た。Sox9CreERT2;RosaTomatoマウスでの解析では、生後、Sox9の発現する細胞が骨格筋でも検出された。Sox9発現領域でScxを欠失するSox9Cre;Scxflox/floxマウスと野生型マウスの顎関節、腱の付着部、頭蓋の縫合部の形態・組織学的変化を解析している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Scxの腱・靱帯特異的転写制御領域の絞り込みは、Tgマウス胚を用いた解析で順調に進んでいる。絞り込んだ領域に、種間で高度に保存されているモチーフも見出されており、Scxの発現を誘導・維持する機構についての手がかりが得られている。腱・靱帯以外でのScxの発現についても、他のマーカー遺伝子の発現を調べることによって、細胞の特性が明らかになりつつある。

今後の研究の推進方策

これまでに同定しているScxの腱・靱帯特異的転写制御領域内で見出されているモチーフの役割について、更に解析を進める。Scxの骨における機能的な役割を明らかにするとともに、Sox9発現領域でScxを欠失するコンディショナルノックアウトマウスの表現型をScx欠失マウスの表現型とも比較しながら解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Digits in a dish: An in vitro system to assess the molecular genetics of hand/foot development at single-cell resolution (2023)
  • 著者名/発表者名: Fuiten Allison M., Yoshimoto Yuki, Shukunami Chisa, Stadler H. Scott
  • 雑誌名: Frontiers in Cell and Developmental Biology 巻: 11 ページ: 1135025
  • DOI: 10.3389/fcell.2023.1135025
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Dexamethasone Is Not Sufficient to Facilitate Tenogenic Differentiation of Dermal Fibroblasts in a 3D Organoid Model (2023)
  • 著者名/発表者名: Kroner-Weigl Niklas、Chu Jin、Rudert Maximilian、Alt Volker、Shukunami Chisa、Docheva Denitsa
  • 雑誌名: Biomedicines 巻: 11 ページ: 772
  • DOI: 10.3390/biomedicines11030772
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 軟骨細胞 (2023)
  • 著者名/発表者名: 内部健太、余 昕怡、山家新勢、宿南知佐
  • 雑誌名: 最新の骨粗鬆症学 (第2版) 日本臨床 巻: 81 ページ: 90-94
• [雑誌論文] The mechanosensitive ion channel PIEZO1 is expressed in tendons and regulates physical performance (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakamichi Ryo, Ma Shang, Nonoyama Takayuki, Chiba Tomoki, Kurimoto Ryota, Ohzono Hiroki, Olmer Merissa, Shukunami Chisa, Fuku Noriyuki, Wang Guan, Morrison Errol, Pitsiladis Yannis P., Ozaki Toshifumi, D’Lima Darryl, Lotz Martin, Patapoutian Ardem, Asahara Hiroshi
  • 雑誌名: Science Translational Medicine 巻: 14 ページ: 5557
  • DOI: 10.1126/scitranslmed.abj5557
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Tendon-Specific Dicer Deficient Mice Exhibit Hypoplastic Tendon Through the Downregulation of Tendon-Related Genes and MicroRNAs (2022)
  • 著者名/発表者名: Omoto Takenori, Yimiti Dilimulati, Sanada Yohei, Toriyama Minoru, Ding Chenyang, Hayashi Yuta, Ikuta Yasunari, Nakasa Tomoyuki, Ishikawa Masakazu, Sano Masayuki, Lee Minjung, Akimoto Takayuki, Shukunami Chisa. Miyaki Shigeru, Adachi Nobuo
  • 雑誌名: Frontiers in Cell and Developmental Biology 巻: 10 ページ: 898428
  • DOI: 10.3389/fcell.2022.898428
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 線維軟骨性エンテーシスの形成・維持に寄与する細胞群の特性解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 山家新勢, 余欣怡, 吉本由紀, 樋口真之輔, 秋山治彦, 安達泰治, 宿南知佐
  • 学会等名: 第40回日本骨代謝学会学術集会
• [学会発表] Pax1による椎間板の成熟と維持の制御 (2022)
  • 著者名/発表者名: 余昕怡, 山家新勢, 樋口真之輔, 宿南知佐
  • 学会等名: 第40回日本骨代謝学会学術集会
• [学会発表] 腱・靭帯分化誘導システムにおけるシングルセル解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 吉本由紀, 上住聡芳, 上住円, 田中かおり, YU Xinyi, 黒澤珠希, 山家新勢, 前原一満, 大川恭行, 外丸祐介, 宿南知佐
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会年会
  • 招待講演
• [備考] 生体分子機能学
  • URL: http://tnmd.hiroshima-u.ac.jp/j_html/j_gyouseki.html