| 研究課題/領域番号 |
21H03358
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
水上 洋一 山口大学, 大学研究推進機構, 教授 (80274158)
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| 研究分担者 |
諌山 慧士朗 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (30780887)
森本 幸生 国際医療福祉大学, 福岡保健医療学部, 教授 (50202362)
渡邉 健司 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (50711264)
大塚 正人 東海大学, 医学部, 教授 (90372945)
小林 茂樹 山口大学, 医学部, 教授(連携講座) (90397993)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 拡張型心筋症 / ゲノム解析 / ゲノム編集マウス / エクソソーム |
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| 研究実績の概要 |
これまでに心筋症や不整脈など心臓疾患を発症することが報告されている57遺伝子の2987領域に対する独自のカスタムパネルを作製した。このマルチプレックス PCRで既知心筋症変異の57 遺伝子全領域(2987産物)98.3% をカバーする。精製したゲノム DNA50ngおよびカスタムパネル(プライマーmix)を用いてIon Ampliseq Library Preparation キットでPCR増幅およびライブラリー作製を行った。Ion S5 Sequencing 200 Kit v2及び318 チップを用いて解析を行う。リファ レンスはヒトゲノム(hg19)を用いてマッピングを行った。さらにこのデータを確認するため、PCRベースでの全エクソン配列を増幅させ、次世代シーケンサー Next-seq500(現有)で全エクソン解析を行った。 次世代シーケンスデータはPartek Flow、Variant Caller、Genomics Work Bench(全て現有)を用いて解析し た結果、12名の孤発性拡張型心筋症のサンプルから3種類の遺伝子で未知の遺伝子変異が検出された。研究分担者によって開発されたGONAD法を用いて、ノックイ ンマウスを作製した。実験は発情期にあるマウスを交配させ、翌日にプラグを確認した後、プラグ確認日にチオペンタール麻酔下、背中側から卵巣を引き出し、 卵管にキャピラリーを通してハイブリダイズしたtracrRNA/crRNAとCAS9タンパク質を注入する。注入直後にin vivoでの電気穿孔法(現有)で卵管内に存在している 受精卵に直接ゲノム編集を行った。その結果、1種類の遺伝子で患者さんと同じ遺伝子変異を有する拡張型心筋症の再現に成功した。現在、血清におけるエクソ ソームを分離し、全miRNAの解析を行うと同時に薬剤を投与し拡張型心筋症の治療を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
作製したヒト拡張型心筋症の遺伝子変異を有するマウスが作製できた。他の患者さまの遺伝子変異を有するゲノム編集マウスについては、心筋症を発症せず、別の遺伝子変異が発症に関与している可能性が高まった。今後のタンパク質の構造などを考慮して他の遺伝子変異を発症するマウスを作製する。
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| 今後の研究の推進方策 |
検出されている10前後の遺伝子変異からタンパク質の構造や遺伝子発現などを考慮して、新たな遺伝子変異をマウスを作製して心筋症の発症を再現する。また、これらのマウスを血清に分泌する成分を分析する。
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