研究課題
本研究では、新規な酵素増感法を開発して、従来のフローサイトメトリー法の感度を大きく向上させて、これまで検出が不可能であった細胞膜抗原を検出できる手法を開発すること、及び、それを用いたがんコンパニオン診断への適用の基礎を検討することを目的とした。検出時におけるバックグラウンドの低減のため、昨年度検討した、ヒト細胞に内在活性が存在しないヒト直交性酵素を用いたELISAで昨年度、その有効性を実証していたが、今年度は、これを酵素反応により細胞に反応して集積するCLAMP型基質に適用した。すなわち、クマリン型のCLAMP基質プローブを設計、合成して細胞膜タンパクの検出を検討したところ、実際にフローサイトメトリーに適用してもバックグラウンドが抑えられることで感度が大きく向上できた。一方、多色化のため、その他の蛍光基を用いたプローブを設計合成したところ、蛍光基にフルオロメチル基を直結させた従来のプローブ設計手法では、蛍光基により、酵素反応後に生じる反応性基であるキノンメチドの反応性が異なり、反応性が下がると、酵素反応後に生じたキノンメチド体が拡散して他の細胞を染めてしまう問題が生じた。そこで、これを解決するため、キノンメチドが生じるユニットを蛍光基から独立させたプローブ構造を発案した。この手法では、酵素反応によりキノンメチドが生じるユニットは蛍光基を変更しても同一であり、反応性は均一にすることができる。この設計概念に則り、まずクマリン型で合成ウィ検討して成功した。本プローブをがん診断に重要なCD44の検出に適用したところ、従来法に比べ格段に高感度なシステムを構築することに成功し、がんコンパニオン診断の実用化のための重要な成果を得ることができた。
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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