| 研究課題/領域番号 |
21H04752
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
青木 不学 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (20175160)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-05 – 2024-03-31
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| キーワード | リプログラミング / ヒストン変異体 / 遺伝子発現 / クロマチン構造 |
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| 研究実績の概要 |
受精前後において、分化した卵から全能性を持つ受精卵へと変化するが、その際に大規模なクロマチン構造の変化を伴う遺伝子発現のリプログラミングが起こる。一方、クロマチンを構成するコアヒストンおよびリンカーヒストンには様々な変異体が存在し、それらがクロマチン構造および遺伝子発現の調節に大きく関わっていることが知られている。そこで本研究では、ヒストン変異体に着目し、遺伝子発現リプログラミングを調節するメカニズムの解明を目指す。
本年度は、受精前後におけるヒストン変異体の置換とクロマチン構造の変化との関連を明らかにすることを目的とした。これまでの研究では、ヒストン変異体のゲノム上の配置については、ChIPやCUT＆RUNによる解析が行われてきているが、これらは単に配置を調べるだけで、クロマチン構造との関連は明らかにできない。そこで、塩析を行った後にCUT＆RUNを行うことでこれらの関連を解析する手法を考案した。すなわち、塩析によるヌクレオソームからのヒストンの離脱を指標としたクロマチン構造の解析とCUT&RUNによる配置の解析を複合させた手法である。
そこでまず予備段階として、EGFPを結合させたH2Bを1、2細胞期胚に取り込ませ、塩濃度を変化させてそのクロマチンからの乖離を調べたところ、クロマチン構造が緩んでいる1細胞期胚では、2細胞期胚と比較して低い塩濃度から乖離が始まっていた。また、H3変異体の特異抗体による免疫染色での検出では、変異体間で乖離が起こる塩濃度に違いが見られた。さらにH3変異体に依存するヒストン修飾に関しても、それらの間で乖離度に違いがあった。しかし、まだ乖離が始まる前の低い塩濃度で処理した際に、未処理のものよりもH3変異体や修飾のシグナルが増加するという現象が見られ、これらは解析の精度に悪影響をもたらすものと考えられ、その改善が必要と考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、ヒストン変異体の配置とクロマチン構造の関連を解析する新しい手法の開発を行った。その際、細胞膜の可溶化、塩濃度、塩処理時間他様々なプロセスについて最適化を行い、クロマチン構造の変化を検出する実験条件を確立した。しかし、概要の欄に記したように、低い塩濃度でシグナルの増加が見られるという予想外の問題が生じ、その解決を図った方が良いかと考えられる状況である。一方で、本手法が、ヒストン変異体だけでなく修飾についても同様に解析が可能ということが明らかにできたという点は当初想定したものを超えた成果と言える。また、CUT&RUNについては、1、2細胞期胚を用いた予備実験を完了しており、上記の問題点が解決でき次第、すぐに塩析からのCUT&RUNの本実験に入れる状況となっている。
したがって、本研究プロジェクトは、全体としてはここまでおおむね順調に進展しているものと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、上記「進捗状況」で記したように、低濃度でのシグナルの増加が見られるという問題点の解決を図る。ただ、仮にこの問題が解決できないとしても、シグナルの増加が実際に乖離が始まる前に起こることから、各変異体のクロマチン構造への関与を明らかにするという本来の実験目的の障害とはならないということも考えられる。これらを吟味したうえで最終的な実験条件を決定し、実際の解析を以下のように進める。
①まずこれまでに当研究室でその発現と局在についての情報を得ているリンカーヒストンのH1fooとH1aについての解析を行うこととする（受精前後に発現しているリンカーヒストンは主にH1fooとH1aのみである）。
②H1fooとH1aをそれぞれノックダウン（siRNAによる）とノックアウトを行い、それによる遺伝子発現とクロマチン構図のゆるにの変化を解析する。
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