肝微小環境の構造理解に基づく新たな代謝性肝疾患治療の確立

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H04823
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 本多 政夫 金沢大学, 保健学系, 教授 (00272980)
• 研究分担者: 堀本 勝久 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 情報・人間工学領域, 招聘研究員 (40238803) ; 土居 信英 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (50327673) ; 岡田 光 金沢大学, 医薬保健学総合研究科, 特任助教 (50788916)
• 研究期間 (年度): 2021-04-05 – 2025-03-31
• キーワード: 肝微小環境 / 類洞内皮細胞 / Sema6A / 肝再生 / 線維化

研究実績の概要

NASHは脂肪化・炎症・線維化を伴って進行し、肝不全や肝発癌発生の要因となる。本申請では、Sema6Aの肝類洞内皮における本来の生理機能を解き明かすことにより、肝再生機構、肝類洞の細動脈化機構、線維化、炎症の機転を解明することを目的とする。また、Sema6Aの発現低下と自律神経系路の分布異常との関連を明らかにし、自律神経制御異常によって引き起こされる肝の代謝障害の機序を解明する。
本年度はCDH5-cre/Sema6Afl/fl/Rosa26-tdTomatoを用いて四塩化炭素肝線維化モデルにおけるSema6A-KO細胞のfateをlinage traceにて検討した。類洞内皮Sema6A-KO細胞はαSMA陽性肝星細胞との接着を消失し、コントロールマウスと比較して約30%の低下が見られた。また一部でコラーゲンを産生する細胞も認められEndoMT（内皮間葉移行）の存在が示唆された。Sema6A-PlxinA2シグナルの詳細を検討し、PlxinA2の細胞内ドメインと結合するRND3のシグナル伝達に必須の燐酸化部位を同定した。Sema6A-PlxinA2シグナルを制御する化合物のスクリーニングのため、独自開発の「パスウェイ変動探索システム」を用いて、米国Broad Instituteの1309種の化合物変動データ、FDA承認薬107種の化合物変動データの超幾何分布に基づくパスウェイ解析を実行し、33の候補化合物を得た。肝細胞選択的なSema6Aのdeliveryを目的に送達効率の高い来膜透過促進ペプチドS39を新たに見出した。さらに、様々な抗原に結合するVHドメイン抗体を創出できる系を確立し、PlxnA2に対するVHドメイン抗体の作成のため、ビーズ固定用のタグを融合したPlxnA2細胞外ドメイン発現用プラスミドを作成し、HEK293細胞で発現した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

類洞内皮細胞特異的Sema6A-KOマウスは、四塩化炭素（CCL4）、胆管結紮（BDL）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（CDAHFD）、メチオニンコリン欠乏飼料（MCD）の4種類の線維化モデルでコントロールマウスと比較して肝線維化形成の顕著な増悪が認められる。本年度はCDH5-cre/Sema6Afl/fl/Rosa26-tdTomatoを用いて四塩化炭素肝線維化モデルにおけるSema6A-KO細胞のfateをlinage traceにて検討し、Sema6aがKOされた類洞内皮細胞とαSMA陽性肝星細胞の隣接率がコントロールマウスと比較して約30%低下を認めた。また一部の細胞で、EndoMT（内皮間葉移行）の存在が確認された。
Sema6A-PlxinA2シグナルを制御する化合物のスクリーニングのため独自開発の「パスウェイ変動探索システム」に入力した。パスウェイ変動探索システムは、米国Broad Instituteが作成した1309種の化合物変動データ、及び独自に構築したFDA承認薬107種の化合物変動データについて、超幾何分布に基づくパスウェイ解析を実行し、33化合物が得られた。
当初の計画で予定していた既存の一本鎖抗体がマウスではなくヒトASGRに結合する抗体であったことと、VHとVLを人工的なリンカーで連結した一本鎖抗体よりもVHのみからなる単一ドメイン抗体のほうが免疫原性のリスクも少なく大量発現も容易であることから、ヒトASGRとマウスASGR（類似性80％）の両方に結合するVHドメイン抗体をmRNAディスプレイ法により新たに創出することにした。Sema6Aとの融合タンパク質の調製は未施行であるが、PlxnA2をターゲットとしたVHドメイン抗体の作成のための準備を終えることができたので、計画全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

類洞内皮特異的Sema6A-KOマウスの部分肝切除モデルを用いてSema6Aの肝再生における役割を明らかにする。CDH5-cre/Sema6Afl/fl/Rosa26-tdTomatoマウスを用いて、肝線維化形成に伴う類洞内皮細胞の小孔の損失を電子顕微鏡で観察し、類洞内皮細胞自体の遺伝子発現変動解析を行う。肝微小循環実験モデルを用いて、門脈内にSema6A蛋白を注入することで、脳内の自律神経の変動が認められることを確認した。Sema6Aの自律神経系に於ける役割を、更に検討していく。
33化合物について、適応疾患、薬効機序、標的分子などをFDA、PMDA、DrugBankから組織的に収納したデータセットに基づいて化合物の特性を整理している。今後、リン酸化解析を実行し、Sema6A-PlxnA2とSema3C-PlxnA2の下流シグナルの相異を検出し、33化合物から更なる絞り込みを行う。
ヒトVHドメイン抗体ライブラリーと抗原（Bait）となるビオチン様タグ付きヒトPlxnA2、マウスASGRおよびヒトASGRを用いて、それらに結合するVHドメイン抗体をmRNAディスプレイ法により創出する。得られたヒトASGRとマウスASGRの両方に結合するVHドメイン抗体とSema6Aとの融合タンパク質を調製し、肝細胞由来培養細胞や初代肝細胞の表面に選択的にdeliveryされることを確認する。

研究成果

• [雑誌論文] Dickkopf-1 Promotes Angiogenesis and is a Biomarker for Hepatic Stem Cell-like Hepatocellular Carcinoma (2022)
  • 著者名/発表者名: Suda Tsuyoshi、Yamashita Taro、Sunagozaka Hajime、Okada Hikari、Nio Kouki、Sakai Yoshio、Yamashita Tatsuya、Mizukoshi Eishiro、Honda Masao、Kaneko Shuichi
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 23 ページ: 2801～2801
  • DOI: 10.3390/ijms23052801
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] BMP9-ID1 Signaling Activates HIF-1α and VEGFA Expression to Promote Tumor Angiogenesis in Hepatocellular Carcinoma (2022)
  • 著者名/発表者名: Chen Han、Nio Kouki、Tang Hong、Yamashita Taro、Okada Hikari、Li Yingyi、Doan Phuong Thi Bich、Li Ru、Lv Junyan、Sakai Yoshio、Yamashita Tatsuya、Mizukoshi Eishiro、Honda Masao、Kaneko Shuichi
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 23 ページ: 1475～1475
  • DOI: 10.3390/ijms23031475
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Oral Corticosteroids Impair Mucin Production and Alter the Posttransplantation Microbiota in the Gut (2022)
  • 著者名/発表者名: Okafuji Hirofumi、Iida Noriho、Kitamura Kazuya、Seishima Jun、Wang Ziyu、Yutani Masahiro、Yoshio Takatoshi、Yamashita Taro、Sakai Yoshio、Honda Masao、Yamashita Tatsuya、Fujinaga Yukako、Shinkura Reiko、Hamaguchi Yasuhito、Mizukoshi Eishiro、Kaneko Shuichi
  • 雑誌名: Digestion 巻: Online ahead of print ページ: 1～18
  • DOI: 10.1159/000522039
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of the membrane penetration-enhancing peptide S19 derived from human syncytin-1 for the intracellular delivery of TAT-fused proteins (2022)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Mayuko、Iwaki Kouta、Kikuchi Moeki、Fujiwara Kei、Doi Nobuhide
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 586 ページ: 63～67
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.11.065
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Chronic liver disease enables gut Enterococcus faecalis colonization to promote liver carcinogenesis (2021)
  • 著者名/発表者名: Iida Noriho、Mizukoshi Eishiro、Yamashita Tatsuya、Yutani Masahiro、Seishima Jun、Wang Ziyu、Arai Kuniaki、Okada Hikari、Yamashita Taro、Sakai Yoshio、Masuo Yusuke、Agustina Rina、Kato Yukio、Fujinaga Yukako、Oshima Masanobu、Honda Masao、Lebreton Fran?ois、Gilmore Michael S.、Kaneko Shuichi
  • 雑誌名: Nature Cancer 巻: 2 ページ: 1039～1054
  • DOI: 10.1038/s43018-021-00251-3
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Characterization of adipose tissue-derived stromal cells of mice with nonalcoholic fatty liver disease and their use for liver repair (2021)
  • 著者名/発表者名: Yano M, Honda M, Wada T, Kaneko S, Sakai Y.（ほか17名、19番目）
  • 雑誌名: Regenerative Therapy 巻: 18 ページ: 497～507
  • DOI: 10.1016/j.reth.2021.11.005
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Eight-year longitudinal study of whole blood gene expression profiles in individuals undergoing long-term medical follow-up (2021)
  • 著者名/発表者名: Sakai Yoshio、Nasti Alessandro、Takeshita Yumie、Okumura Miki、Kitajima Shinji、Honda Masao、Wada Takashi、Nakamura Seiji、Takamura Toshinari、Tamura Takuro、Matsubara Kenichi、Kaneko Shuichi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 11 ページ: 16564～16564
  • DOI: 10.1038/s41598-021-96078-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Decline in serum albumin concentration is a predictor of serious events in nonalcoholic fatty liver disease (2021)
  • 著者名/発表者名: Kawaguchi Kazunori、Sakai Yoshio、Terashima Takeshi、Shimode Tetsuhiro、Seki Akihiro、Orita Noriaki、Takeshita Yumie、Shimakami Tetsuro、Takatori Hajime、Arai Kuniaki、Kitamura Kazuya、Yamashita Taro、Yamashita Tatsuya、Takamura Masayuki、Mizukoshi Eishiro、Takamura Toshinari、Honda Masao、Wada Takashi、Kaneko Shuichi
  • 雑誌名: Medicine 巻: 100 ページ: e26835～e26835
  • DOI: 10.1097/MD.0000000000026835
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effect of Microbiome on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and the Role of Probiotics, Prebiotics, and Biogenics (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagashimada Mayumi、Honda Masao
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 22 ページ: 8008～8008
  • DOI: 10.3390/ijms22158008
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Dysbiotic gut microbiota in pancreatic cancer patients form correlation networks with the oral microbiota and prognostic factors. (2021)
  • 著者名/発表者名: Matsukawa H, Iida N, Kitamura K, Terashima T, Seishima J, Makino I, Kannon T, Hosomichi K, Yamashita T, Sakai Y, Honda M, Yamashita T, Mizukoshi E, Kaneko S.
  • 雑誌名: Am J Cancer Res. 巻: 11 ページ: 3163～3175
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishment of liver tumor cell lines from atherogenic and high fat diet fed hepatitis C virus transgenic mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Shirasaki Takayoshi、Murai Kazuhisa、Honda Masao、Okada Hikari、Innami Yuika、Yamada Atsumu、Shimakami Tetsuro、Kawaguchi Kazunori、Yamashita Taro、Sakai Yoshio、Kaneko Shuichi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 11 ページ: 13021～13021
  • DOI: 10.1038/s41598-021-92128-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Restorative effect of adipose tissue-derived stem cells on impaired hepatocytes through Notch signaling in non-alcoholic steatohepatitis mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Ishida Kosuke、Seki Akihiro、Kawaguchi Kazunori、Nasti Alessandro、Yamato Masatoshi、Inui Hiiro、Komura Takuya、Yamashita Taro、Arai Kuniaki、Yamashita Tatsuya、Mizukoshi Eishiro、Honda Masao、Wada Takashi、Harada Kenichi、Kaneko Shuichi、Sakai Yoshio
  • 雑誌名: Stem Cell Research 巻: 54 ページ: 102425～102425
  • DOI: 10.1016/j.scr.2021.102425
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Clinical trial of autologous adipose tissue-derived regenerative (stem) cells therapy for exploration of its safety and efficacy (2021)
  • 著者名/発表者名: Sakai Y, Fukunishi S, Takamura M, Kawaguchi K, Inoue O, Usui S, Takashima S, Seki A, Asai A, Tsuchimoto Y, Nasti A, Bich Ho TT, Imai Y, Yoshimura K, Murayama T, Yamashita T, Arai K, Yamashita T, Mizukoshi E, Honda M, Wada T, Harada K, Higuchi K, Kaneko S.
  • 雑誌名: Regenerative Therapy 巻: 18 ページ: 97～101
  • DOI: 10.1016/j.reth.2021.04.003
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] BMP9‐ID1 signaling promotes EpCAM‐positive cancer stem cell properties in hepatocellular carcinoma (2021)
  • 著者名/発表者名: Chen H, Nio K, Yamashita T, Okada H, Li R, Suda T, Li Y, Doan PTB, Seki A, Nakagawa H, Toyama T, Terashima T, Iida N, Shimakami T, Takatori H, Kawaguchi K, Sakai Y, Yamashita T, Mizukoshi E, Honda M, Kaneko S.
  • 雑誌名: Molecular Oncology 巻: 15 ページ: 2203～2218
  • DOI: 10.1002/1878-0261.12963
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The characteristics of the immune cell profiles in peripheral blood in cholangiocarcinoma patients (2021)
  • 著者名/発表者名: Kida Akihiko、Mizukoshi Eishiro、Kido Hidenori、Toyama Tadashi、Terashima Takeshi、Arai Kuniaki、Yamashita Tatsuya、Fushimi Kazumi、Yamashita Taro、Sakai Yoshio、Honda Masao、Uchiyama Akio、Sakai Akito、Shimizu Koichi、Kaneko Shuichi
  • 雑誌名: Hepatology International 巻: 15 ページ: 695～706
  • DOI: 10.1007/s12072-021-10177-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Serum Laminin γ2 Monomer as a Diagnostic and Predictive Biomarker for Hepatocellular Carcinoma (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamashita T, Koshikawa N, Shimakami T, Terashima T, Nakagawa M, Nio K, Horii R, Iida N, Kawaguchi K, Arai K, Sakai Y, Yamashita T, Mizukoshi E, Honda M, Kitao A, Kobayashi S, Takahara S, Imai Y, Yoshimura K, Murayama T, Nakamoto Y, Yoshida E, Yoshimura T, Seiki M, Kaneko S.
  • 雑誌名: Hepatology 巻: 74 ページ: 760～775
  • DOI: 10.1002/hep.31758
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Assessing the activation/inhibition of tyrosine kinase‐related pathways with a newly developed platform (2021)
  • 著者名/発表者名: Kagiwada Harumi、Kiboku Takayuki、Matsuo Hitomi、Kitazawa Masashi、Fukui Kazuhiko、Horimoto Katsuhisa
  • 雑誌名: PROTEOMICS 巻: 21 ページ: 2000251～2000251
  • DOI: 10.1002/pmic.202000251
  • 査読あり
• [学会発表] 核酸アナログ治療中における肝細胞がん再発リスクの検討 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川口和紀, 本多政夫, 金子周一
  • 学会等名: 第107回日本消化器病学会総会
• [学会発表] 長鎖ノンコーディングRNA、HULCによるC型肝炎ウイルス感染制御 (2021)
  • 著者名/発表者名: 島上哲朗, 本多政夫, 金子周一
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会
• [学会発表] C型肝炎ウイルス排除後における背景肝メチル化と肝発癌 (2021)
  • 著者名/発表者名: 西川昌志, 本多政夫, 金子周一
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会
• [学会発表] 発光タグHiBiTを利用したB型肝炎ウイルス複製モニタリングシステムの構築 (2021)
  • 著者名/発表者名: 島上哲朗, 本多政夫, 金子周一
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会
• [学会発表] アルドケト還元酵素1B10の慢性肝疾患進展マーカーとしての意義 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川口和紀、本多政夫、金子周一
  • 学会等名: 第29回JDDW
• [学会発表] DOCK11 might be a candidate druggable target for HBV cure (2021)
  • 著者名/発表者名: Ying-Yi Li, Masao Honda, and Shuichi Kaneko
  • 学会等名: 第29回JDDW
• [学会発表] Endothelial cells affect HBV replication in hepatocytes in a non-contact manner (2021)
  • 著者名/発表者名: Tetsuhiro Shimode, Kazunori Kawaguchi, Masao Honda, Yoshio Sakai, Tatsuya Yamashita, Eishiro Mizukoshi, Shuichi Kaneko
  • 学会等名: AASLD2021
  • 国際学会
• [学会発表] Semaphorin 6A を介した肝類洞内皮と星細胞のクロストークによる肝線維化抑制機序 (2021)
  • 著者名/発表者名: 岡田 光, 本多政夫, 金子周一
  • 学会等名: 第44回日本肝臓学会西部会
• [学会発表] 肝がんにおける腫瘍免疫抑制分子の同定 (2021)
  • 著者名/発表者名: 村居和寿, 本多政夫, 金子周一
  • 学会等名: 第44回日本肝臓学会西部会
• [学会発表] Second extracellular loop of human CD9 is a cell-penetrating peptide (2021)
  • 著者名/発表者名: Kumeno, Y., Sudo, K., Fujiwara, K., Doi, N.
  • 学会等名: The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies
  • 国際学会
• [学会発表] Application of human syncytin1-derived fusogenic peptide to direct intracellular delivery of Cas9 protein-gRNA complex (2021)
  • 著者名/発表者名: Furuya, T., Fujiwara, K., Doi, N.
  • 学会等名: The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies
  • 国際学会
• [学会発表] がん細胞選択的DDSに向けたEGFRに対する環境応答性単一ドメイン抗体の創出 (2021)
  • 著者名/発表者名: 明石尚之，清野真梨子，藤原慶，土居信英
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会