| 研究課題/領域番号 |
21H04841
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
西村 理行 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (60294112)
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| 研究分担者 |
波多 賢二 大阪大学, 大学院歯学研究科, 准教授 (80444496)
高畑 佳史 大阪大学, 大学院歯学研究科, 助教 (60635845)
村上 智彦 大阪大学, 大学院歯学研究科, 講師 (50510723)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-05 – 2024-03-31
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| キーワード | 軟骨 / 骨 / 転写因子 / Zfhx4 |
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| 研究実績の概要 |
１．Zfhx3およびZfhx4の標的遺伝子を解析するために、Flagタグを付与したZfhx4ノックインマウスから細胞を採取し、抗Flag抗体を用いたクロマチン免疫沈降法の条件検討を行い、その最適化を行った。またクロマチン構造の解析を行うために、従来より行われているATAC-seq解析より鋭敏であるとされている、Cut&Run法での解析手法の解析化を行った。これらの研究結果より、Flag-Zfhx4ノックインマウスの骨芽細胞、軟骨細胞および肢芽細胞を用いて、分子生物学的解析を行う基盤が構築できた。
２．Zfhx3シングルノックアウトマウスを用いて、Zfhx3の骨格形成における解析を行った。その結果、Zfhx3ノックアウトでは、明確な骨格形成異常を認めなかった。この解析結果より、骨格形成におけるZfhx3の機能は、Zfhx4により代償されいると推測された。そこで、Zfhx3およびZfhx4ダブルノックアウトマウスを作製したが、早期致死を来たしているようため、その解析は困難であった。この点を解消するために、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を用いて、Zfhx3 floxマウスの作製に取り掛かった。令和４年度までに、Zfhx3の遺伝子座に一箇所のloxP配列を挿入したマウスの作製を行った。ゲノムDNAを用いたPCRおよびDNAシークエンス解析により、loxP配列の挿入を確認できた。引き続き、Zfhx3遺伝子座のもう一箇所にloxP配列を挿入して、Zfhx3コンディショナルノックアウトマウスの作製を進め、最終的にはZfhx3およびZfhx4コンディショナルノックアウトマウスの作製ならびに解析を行う体制が整った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１．Zfhx3ノックアウトマウスを作製し、その表現型の解析を行った。
２．Zfhx3 floxマウス作製の第一ステップを完了できた。
３．標的遺伝子およびクロマチン構造の解析の再現性、鋭敏性、および技術的困難さを解消できるCut&Run法の導入と実験の最適化を行った。
以上の事由を総合的に考慮し、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．Zfhx3およびZfhx4ダブルノックアウトマウスを作製し、その表現型を病理組織学的解析、分子生物学的解析およびex vivoにての解析にて検索する。
２．Zfhx4の標的遺伝子の同定と解析を実施する。
３．Zfhx4が構成する転写複合体を同定し、その構成分子の機能解析を行う。
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