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2022 年度 実績報告書

非環状型人工核酸による人工遺伝システムの創成とその進化分子工学への応用

研究課題

研究課題/領域番号 21H05025
研究機関名古屋大学

研究代表者

浅沼 浩之  名古屋大学, 工学研究科, 教授 (20282577)

研究分担者 根本 直人  埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60509727)
研究期間 (年度) 2021-07-05 – 2026-03-31
キーワード人工核酸 / Pre-RNA world / 化学ライゲーション / SNA / L-aTNA
研究実績の概要

L-aTNAの複製と同様にL-aTNAのランダム配列プールを使用して、17-merの鋳型DNA鎖およびRNA鎖のL-aTNA鎖への逆転写を検討した。DNAを鋳型鎖に用いた場合は、L-aTNA 4 merのランダム配列プールを用い16 merのDNA鋳型鎖と8 merのL-aTNAプライマーで逆転写を実現した。一方RNAを鋳型に用いた場合は、L-aTNAの複製と同じ3-merのランダム配列プールでL-aTNAへの逆転写を実現した。
DNAを鋳型鎖に用いてDNA鎖の非酵素的ライゲーションを検討した結果、Mn2+よりCd2+, Co2+, Ni2+など、イミダゾールと強く相互作用する金属イオンの方がライゲーション活性の向上が顕著であった。Cd2+で最適化したところ、酵素(リガーゼ)に匹敵する活性が得られた。さらに反応速度論解析から、CNImによるリン酸の活性化が律速段階であることが判明した。その解析を基にL-aTNA鎖のプライマー伸長反応を再検討し、伸長方向をこれまでの逆の1’→3‘にしてCd2+を使用することで、29merのL-aTNA鋳型鎖を4℃4時間で80%以上の収率で得られた。
前年度配列既知の10 merのSNAに対して相補配列を持つDNAを、そのランダムプールから釣り上げられることを示した。そこで更に長い20 merのSNAを釣り上げる方法を検討した。その結果、中央に配列既知の2 merを挿入してランダマイズしたDNA 10merを使用すれば、20 merのSNAに対して10 merずつ分割して相補的なDNAが釣れることが判った。
前年度開始する予定だったL-aTNA鎖のサーマルサイクルによる自己複製を検討した。まずは16 merのL-aTNA鋳型鎖に相補的な2つの8 merのL-aTNAフラグメントの連結反応がサーマルサイクルで自己増幅可能か検討した。鋳型鎖に対してプライマーとフラグメント鎖を過剰に加え、連結反応(2h, 25℃)→加熱(94℃)→急冷(0℃)というサイクルを回したところ、サイクル毎に連結産物の増加が観察され、4サイクル後は鋳型鎖に対して150%の収率で連結産物が得られた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

前年度コロナのため検討できなかったL-aTNAの線形増幅を、令和4年度に計画していた研究を全て達成した上、さらに思いがけずリガーゼに匹敵するDNAの非酵素的ライゲーションを実現したので、当初の計画以上に進展したと判断した。具体的な進捗状況を以下に示す。
(1)L-aTNAの線形増幅: 鋳型鎖に対してプライマーとフラグメント鎖を過剰に加え、連結反応(2h, 25℃)→加熱(94℃)→急冷(0℃)というサイクルを回したところ、サイクル毎に連結産物の増加が観察され、4サイクル後は鋳型鎖に対して150%の収率で連結産物が得られた。(2)DNA(RNA)→L-aTNAへの非酵素的逆転写: L-aTNA 4 merのランダム配列プールを用い16 merのDNA鋳型鎖と8 merのL-aTNAプライマーで15(w/v)%のPEG6000存在下で連結反応を行ったところ、4℃24時間で完全長のL-aTNA鎖が収率30%で逆転写産物が得られた。一方鋳型鎖をRNAに代えたところ、さらに高効率(収率59%)で逆転写産物が得られた。(3)L-aTNA→DNAへの配列転写:20 mer程度の長いSNAの配列をDNA配列に転写する高効率な手法を開発した。(4)DNAの化学ライゲーション:Mn2+よりもCd2+, Co2+, Ni2+などイミダゾールと強く相互作用する金属イオンを用いることで、酵素に匹敵する非酵素的ライゲーションを実現した。(5)長鎖L-aTNAのプライマー伸長反応:化学ライゲーションの機構解明結果を基に、金属イオンにCd2+を用い、ライゲーションの方向をこれまでの逆の1’→3’に代えたところ、29 merのL-aTNA鎖を4℃4時間で80%以上の収率を達成した。

今後の研究の推進方策

これまでの成果と研究計画に基づき、以下の方針で研究を推進する。
1)L-aTNA鎖の自己増幅:前年度線形増幅を実現したので、PCRと同様の指数関数的増幅システムを構築する。具体的にはに示すように、増幅したい鋳型二重鎖(例えば12merの二重鎖)に対して、それぞれに対応する(逆)プライマー鎖(例えば6 mer、2種類)とフラグメント鎖(例えば3 mer、4種類)を用意する。プライマー鎖とフラグメント鎖は過剰に加え、PCRと同様に加熱・急冷(ヒートショック)・連結反応を繰り返すことで指数関数的増幅を目指す。
2)金属錯体化による連結反応の高速化:二価金属イオンにCd2+に使用するだけでも10倍近く連結反応が促進されたが、他にもCo2+, Ni2+などイミダゾールとの錯形成しやすい金属ほど活性の向上が見られた。そこでイミダゾールを用いた配位子を検討する。配位子のイミダゾールがBrCNとの反応でCNImが中間体として生成することを期待し、CNImの代わりにBrCNを使用する。高活性化が可能なリガンドが得られた場合には、L-aTNA鎖の自己増幅、逆転写にも応用する。
3)L-aTNA→DNAへの配列転写:L-aTNAアプタマー取得に向けて、ストレプトアビジン修飾磁気ビーズを使わず全て水溶液中で行えるL-aTNA→DNA配列転写法も検討する。これが実現すれば、磁気ビーズに非特異的吸着したDNAの誤検出を回避することができる。

  • 研究成果

    (54件)

すべて 2023 2022

すべて 雑誌論文 (14件) (うち査読あり 13件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (35件) (うち国際学会 2件、 招待講演 1件) 図書 (2件) 産業財産権 (3件) (うち外国 1件)

  • [雑誌論文] A novel agonist with homobivalent single-domain antibodies that bind the FGF receptor 1 domain III functions as an FGF2 ligand2023

    • 著者名/発表者名
      Yonehara Ryo、Kumachi Shigefumi、Kashiwagi Kenji、Wakabayashi-Nakao Kanako、Motohashi Maiko、Murakami Taihei、Yanagisawa Teruhiko、Arai Hidenao、Murakami Akikazu、Ueno Yukio、Nemoto Naoto、Tsuchiya Masayuki
    • 雑誌名

      Journal of Biological Chemistry

      巻: 299 ページ: 102804~102804

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2022.102804

    • 査読あり
  • [雑誌論文] RNA以前の世界を妄想する2022

    • 著者名/発表者名
      浅沼浩之、村山恵司
    • 雑誌名

      化学と工業

      巻: 75(8) ページ: 552-554

  • [雑誌論文] DNA二重鎖を利用したFRET配向依存性の検討2022

    • 著者名/発表者名
      樫田 啓, 浅沼浩之
    • 雑誌名

      光化学

      巻: 53(3) ページ: 148-153

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Unexpected Dissociation of Photoresponsive UV-ON DNA Carrying p-tert-Butyl Azobenzene under UV Light Irradiation2022

    • 著者名/発表者名
      Ishii Satsuki、Murayama Keiji、Sada Kazuki、Asanuma Hiroyuki、Kakugo Akira
    • 雑誌名

      Chemistry Letters

      巻: 51 ページ: 292~295

    • DOI

      10.1246/cl.210788

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Signal Amplification Circuit Composed of Serinol Nucleic Acid for RNA Detection2022

    • 著者名/発表者名
      Chen Yanglingzhi、Murayama Keiji、Asanuma Hiroyuki
    • 雑誌名

      Chemistry Letters

      巻: 51 ページ: 330~333

    • DOI

      10.1246/cl.210813

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Color-Changing Fluorescent Barcode Based on Strand Displacement Reaction Enables Simple Multiplexed Labeling2022

    • 著者名/発表者名
      Makino Koki、Susaki Etsuo A.、Endo Motomu、Asanuma Hiroyuki、Kashida Hiromu
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 144 ページ: 1572~1579

    • DOI

      10.1021/jacs.1c09844

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Renewable DNA Proportional-Integral Controller with Photoresponsive Molecules2022

    • 著者名/発表者名
      Tamba Masaaki、Murayama Keiji、Asanuma Hiroyuki、Nakakuki Takashi
    • 雑誌名

      Micromachines

      巻: 13 ページ: 193~193

    • DOI

      10.3390/mi13020193

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Orthogonal Amplification Circuits Composed of Acyclic Nucleic Acids Enable RNA Detection2022

    • 著者名/発表者名
      Chen Yanglingzhi、Nagao Ryuya、Murayama Keiji、Asanuma Hiroyuki
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 144 ページ: 5887~5892

    • DOI

      10.1021/jacs.1c12659

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Methyl group configuration on acyclic threoninol nucleic acids (aTNAs) impacts supramolecular properties2022

    • 著者名/発表者名
      Murayama Keiji、Kashida Hiromu、Asanuma Hiroyuki
    • 雑誌名

      Organic & Biomolecular Chemistry

      巻: 20 ページ: 4115~4122

    • DOI

      10.1039/d2ob00266c

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Cooperative cargo transportation by a swarm of molecular machines2022

    • 著者名/発表者名
      Akter M.、Keya J. J.、Kayano K.、Kabir A. M. R.、Inoue D.、Hess H.、Sada K.、Kuzuya A.、Asanuma H.、Kakugo A.
    • 雑誌名

      Science Robotics

      巻: 7 ページ: eabm0677-

    • DOI

      10.1126/scirobotics.abm0677

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Kinesin motors driven microtubule swarming triggered by UV light2022

    • 著者名/発表者名
      Ishii Satsuki、Akter Mousumi、Murayama Keiji、Kabir Arif Md. Rashedul、Asanuma Hiroyuki、Sada Kazuki、Kakugo Akira
    • 雑誌名

      Polymer Journal

      巻: 54 ページ: 1501~1507

    • DOI

      10.1038/s41428-022-00693-1

    • 査読あり
  • [雑誌論文] DNA Concentration Regulator That can be Driven for a Long Time2022

    • 著者名/発表者名
      Nakakuki Takashi、Murayama Keiji、Asanuma Hiroyuki
    • 雑誌名

      New Generation Computing

      巻: 40 ページ: 681~702

    • DOI

      10.1007/s00354-022-00173-3

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Construction of a Humanized Artificial VHH Library Reproducing Structural Features of Camelid VHHs for Therapeutics2022

    • 著者名/発表者名
      Murakami Taihei、Kumachi Shigefumi、Matsunaga Yasuhiro、Sato Miwa、Wakabayashi-Nakao Kanako、Masaki Hidekazu、Yonehara Ryo、Motohashi Maiko、Nemoto Naoto、Tsuchiya Masayuki
    • 雑誌名

      Antibodies

      巻: 11 ページ: 10~10

    • DOI

      10.3390/antib11010010

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Comprehensive analysis of transglutaminase substrate preference by cDNA display coupled with next-generation sequencing and bioinformatics2022

    • 著者名/発表者名
      Damnjanovic Jasmina、Odake Nana、Fan Jicheng、Camagna Maurizio、Jia Beixi、Kojima Takaaki、Nemoto Naoto、Hitomi Kiyotaka、Nakano Hideo
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 12 ページ: 13578-13578

    • DOI

      10.1038/s41598-022-17494-4

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 反応メカニズム解析に基づく人工核酸L-aTNAの化学的な鎖伸長反応の高効率化2023

    • 著者名/発表者名
      沖田ひかり, 村山恵司, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
  • [学会発表] 二重鎖形成を利用した人工核酸配列解析法の開発2023

    • 著者名/発表者名
      樫田 啓, 香川恵未莉, 清水優香, 戸谷恵介, 愛場雄一郎, 荘司長三, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
  • [学会発表] 非環状型人工核酸を用いたGapmer型アンチセンス核酸の毒性軽減法の開発2023

    • 著者名/発表者名
      樋口昌也, 神谷由紀子, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
  • [学会発表] 非環状型人工核酸SNA, L-aTNAの細胞内取り込み経路と細胞内動態の解析2023

    • 著者名/発表者名
      神谷由紀子, 坂下清佳, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
  • [学会発表] 非環状型人工核酸が形成するユニークな三重鎖構造2023

    • 著者名/発表者名
      神谷由紀子, 労 思源, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
  • [学会発表] 三重鎖の光制御を目指した8-Pyrenylvinyl adenine導入L-aTNAの開発2023

    • 著者名/発表者名
      平野桂人, 村山恵司, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
  • [学会発表] Ru(II)錯体導入DNAによるスチルベンの可視光二量化反応2023

    • 著者名/発表者名
      東 秀憲, 浅沼浩之, 樫田 啓
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
  • [学会発表] 非環状型人工核酸の修飾によるGapmer型アンチセンス核酸の毒性軽減法の開発2023

    • 著者名/発表者名
      樋口昌也, 神谷由紀子, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本薬学会 第143年会
  • [学会発表] 非環状型人工核酸SNA, L-aTNAの細胞内導入経路と細胞内動態の解析2023

    • 著者名/発表者名
      神谷由紀子, 坂下清佳, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本薬学会 第143年会
  • [学会発表] Pseudo-complementary SNA/L-aTNAの合成と自己二重鎖形成の抑制2023

    • 著者名/発表者名
      佐藤史経, 神谷由紀子, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本薬学会 第143年会
  • [学会発表] Pre-RNAワールド実証に向けた非環状型人工核酸(L-aTNA)の進化工学2023

    • 著者名/発表者名
      瀧澤佐恵、沖田ひかり、村山恵司、浅沼浩之、根本直人
    • 学会等名
      第45回日本分子生物学会
  • [学会発表] 新たな創薬モダリティとしての非環状型人工核酸2022

    • 著者名/発表者名
      浅沼浩之
    • 学会等名
      Link-J "名古屋大学発!先進的な取り組み事例×展望 vol.2 ~核酸医薬開発の新展開~"
    • 招待講演
  • [学会発表] N-シアノイミダゾールを利用したDNA ケミカルライゲーションの高速化と応用2022

    • 著者名/発表者名
      近藤修斗、沖田ひかり、村山恵司、浅沼浩之
    • 学会等名
      第32回バイオ・高分子シンポジウム
  • [学会発表] 人工核酸aTNAを利用した直交性HCRの開発とRNA検出への応用2022

    • 著者名/発表者名
      村山恵司、陳 楊凌志、長尾竜弥、浅沼浩之
    • 学会等名
      第32回バイオ・高分子シンポジウム
  • [学会発表] 人工核酸L-aTNA・SNAを用いた非酵素的な鋳型重合の反応速度論解析と転写法への応用2022

    • 著者名/発表者名
      沖田ひかり、村山恵司、浅沼浩之
    • 学会等名
      第32回バイオ・高分子シンポジウム
  • [学会発表] 核酸の鎖交換反応を利用した蛍光色変化型バーコードによる多重タンパク質イメージング2022

    • 著者名/発表者名
      牧野航海、浅沼浩之、樫田 啓
    • 学会等名
      第32回バイオ・高分子シンポジウム
  • [学会発表] 非環状型人工核酸からなるエキソンスキップ型アンチセンス核酸の評価2022

    • 著者名/発表者名
      神谷由紀子, 崔茜茜, 桑島諒太, 浅沼浩之
    • 学会等名
      日本核酸医薬学会第7回年会
  • [学会発表] FRET型プローブによるSNA型AMOと標的miRNAの相互作用の可視化2022

    • 著者名/発表者名
      朱 紅宇、神谷由紀子、浅沼浩之
    • 学会等名
      日本核酸医薬学会第7回年会
  • [学会発表] 塩基条件下で脱保護可能なPseudo-complementary SNA/L-aTNA amidite monomerの合成2022

    • 著者名/発表者名
      佐藤史経、神谷由紀子、浅沼浩之
    • 学会等名
      日本核酸医薬学会第7回年会
  • [学会発表] 人工核酸L-aTNAの非酵素的な鋳型重合の速度論解析に基づく長鎖伸長反応法の開発2022

    • 著者名/発表者名
      沖田ひかり、村山恵司、浅沼浩之
    • 学会等名
      第71回高分子討論会
  • [学会発表] 蛍光色が変化する核酸蛍光バーコードを用いたタンパク質のマルチイメージング2022

    • 著者名/発表者名
      牧野航海、浅沼浩之、樫田 啓
    • 学会等名
      第71回高分子討論会
  • [学会発表] 非環状型XNAを利用した直交性シグナル増幅回路の開発とRNA検出への応用2022

    • 著者名/発表者名
      村山恵司、陳 楊凌志、長尾竜弥、浅沼浩之
    • 学会等名
      第71回高分子討論会
  • [学会発表] DNAを利用した色素-金属錯体間エネルギー移動の検討2022

    • 著者名/発表者名
      東 秀憲、浅沼浩之、樫田 啓
    • 学会等名
      第16回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] 人工核酸L-aTNAとSNAの化学的な鋳型合成の速度論解析を基盤とした長鎖伸長反応法の構築2022

    • 著者名/発表者名
      沖田ひかり、村山恵司、浅沼浩之
    • 学会等名
      第16回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] 塩基性条件下で脱保護可能なPseudo-complementary核酸塩基のSNA/L-aTNAホスホロアミダイトモノマーの合成2022

    • 著者名/発表者名
      佐藤史経、神谷由紀子、浅沼浩之
    • 学会等名
      第16回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] SNA型抗アンチセンス核酸の細胞内作用機構解明に向けたFRET検出システムの開発2022

    • 著者名/発表者名
      朱 紅宇、神谷由紀子、浅沼浩之
    • 学会等名
      第16回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] 光クロスリンク解析によるDicer-Platform/PAZのRNAコンタクトサイトの探索2022

    • 著者名/発表者名
      神谷由紀子、鈴木駿也、横田徳子、津田弘貴、吉田健司、浅沼浩之
    • 学会等名
      第16回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] 非環状型XNAで構成される直交性シグナル増幅回路の開発とRNA検出への応用2022

    • 著者名/発表者名
      村山恵司、陳 楊凌志、長尾竜弥、浅沼浩之
    • 学会等名
      第16回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] DNA junctionを利用した色素-金属錯体間エネルギー移動の検討2022

    • 著者名/発表者名
      東 秀憲、浅沼浩之、樫田 啓
    • 学会等名
      2022年光化学討論会
  • [学会発表] N-シアノイミダゾールを利用したケミカルライゲーションの高速化と長鎖DNA合成への応用2022

    • 著者名/発表者名
      近藤修斗、沖田ひかり、村山恵司、浅沼浩之
    • 学会等名
      第183回東海高分子研究会講演会
  • [学会発表] Elongation of long L-aTNA strand based on the kinetic analysis of chemical templatedirected synthesis2022

    • 著者名/発表者名
      Hikari Okita, Keiji Murayama, Hiroyuki Asanuma
    • 学会等名
      ISNAC 2022
    • 国際学会
  • [学会発表] Multiplexed Imaging with Color-Changing Fluorescent Barcode Based on Strand Displacement Reaction2022

    • 著者名/発表者名
      Koki Makino, Hiroyuki Asanuma, Hiromu Kashida
    • 学会等名
      ISNAC 2022
    • 国際学会
  • [学会発表] DNA junctionに多数の蛍光色素を集積した光捕集アンテナの開発2022

    • 著者名/発表者名
      東 秀憲、浅沼浩之、樫田 啓
    • 学会等名
      第53回 中部化学関係学協会支部連合秋季大会
  • [学会発表] 非環状型XNAを利用した機能性ハイドロゲルの開発2022

    • 著者名/発表者名
      村山恵司、重松勇貴、奥田祐登、浅沼浩之
    • 学会等名
      第53回 中部化学関係学協会支部連合秋季大会
  • [学会発表] 人工核酸XNAを利用した直交性回路及び鎖連結法の開発2022

    • 著者名/発表者名
      村山恵司、陳 楊凌志、長尾竜弥、沖田ひかり、近藤修斗、浅沼浩之
    • 学会等名
      第6回分子ロボティクス年次大会
  • [図書] Orthogonality of Nucleic Acids2022

    • 著者名/発表者名
      Keiji Murayama, Hiroyuki Asanuma
    • 総ページ数
      7
    • 出版者
      Springer
  • [図書] DNAポリマー (高分子材料の辞典)2022

    • 著者名/発表者名
      村山恵司、浅沼浩之
    • 総ページ数
      2
    • 出版者
      朝倉書店
  • [産業財産権] アミダイトモノマー2022

    • 発明者名
      浅沼浩之、神谷由紀子、佐藤史経
    • 権利者名
      国立大学法人東海国立大学機構
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      PCT/JP2022/047371
    • 外国
  • [産業財産権] 配列解析方法2022

    • 発明者名
      浅沼浩之、村山 恵司、根本 直人、瀧澤 佐恵
    • 権利者名
      国立大学法人東海国立大学機構、EME
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願2022-177900
  • [産業財産権] 配列解析方法2022

    • 発明者名
      樫田啓、香川恵未莉、浅沼浩之、村山 恵司、根本 直人、清水優香
    • 権利者名
      国立大学法人東海国立大学機構、EME
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願2022-032911

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公開日: 2023-12-25  

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