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2021 年度 実績報告書

細胞内侵入型抗狂犬病ウイルス中和モノクローナル抗体の探索と治療への応用

研究課題

研究課題/領域番号 21J13419
研究機関北海道大学

研究代表者

板倉 友香里  北海道大学, 国際感染症学院, 特別研究員(DC2)

研究期間 (年度) 2021-04-28 – 2023-03-31
キーワード狂犬病ウイルス / 抗体療法 / 細胞膜透過性ペプチド
研究実績の概要

【RABV免疫抗原の作出とマウスへの免疫】
RABVゲノム複製を担う因子の一つであるP蛋白質を抗体の標的候補とし、免疫抗原の作出を試みた。Hisタグ融合P蛋白質を発現、精製後、マウスに免疫した。また、HAタグ融合P蛋白質の発現細胞を用いて、抗P蛋白質抗体を検出するためのELISAを構築し、免疫したマウスにおける抗体産生を確認した。
【抗体クローンの選抜方法の検討】
今後取得するモノクローナル抗体の中から、P蛋白質に結合し、RABVのゲノム複製を阻害する抗体クローンを選抜する。第一スクリーニングとして、構築したELISAを実施し、P蛋白質に対する結合性を抗体クローンごとに評価する。また、第二スクリーニングとして、in vitro RNAポリメラーゼアッセイの構築を試みた。その結果、ウイルスゲノム複製を担う蛋白質の存在下で、RNA合成のシグナル増加が認められた。今後、構築したin vitro RNAポリメラーゼアッセイの至適条件を検討する。
【細胞膜透過性ペプチドの選抜】
抗体の細胞内移行に適した細胞膜透過性ペプチド(CPP: Cell Penetrating Peptide)とその付加部位を検討した。IgG抗体の、重鎖あるいは軽鎖のC末端に、6種類のCPPを付加し、計12種類のCPP付加IgG抗体を組換え蛋白質として作出した。標的蛋白質に対する結合性をELISAで評価した結果、全てのCPP付加IgG抗体は、CPPの付加により結合性が変化しなかった。また、免疫染色法、及びイムノブロット法により、CPPを付加した抗体が細胞内に移行することが確かめられた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

免疫抗原作出において、当初想定していなかった技術的な問題の解決に時間を要したため、モノクローナル抗体の取得がやや遅れているものの、マウスへの免疫を完了し、P蛋白質に対する抗体が誘導されていることを確認した。一方、抗体クローンの評価系の構築、及び抗体の細胞内移行に適したCPPの評価は順調に進んでおり、モノクローナル抗体が取得でき次第、抗体クローンの選抜が実施可能である。したがって、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断する。

今後の研究の推進方策

既にP蛋白質に対する抗体産生を確認したマウスより、ハイブリドーマ法、およびB細胞分離培養法を用いてモノクローナル抗体の取得を進める。また、既に構築した評価系により、モノクローナル抗体のスクリーニングを実施し、RABVのゲノム複製を阻害する抗体クローンを選抜する。さらに、CPPを付加した組換え蛋白質として抗体を作製し、細胞内への移行性を確認後、RABV感染細胞における中和能を評価する。感染細胞でRABV増殖阻害を認めた場合、マウスを用いたRABV感染系において、作出した抗体の狂犬病治療効果を評価する。同時に、その他のウイルス蛋白質に対する抗体の作出を進め、最終的にRABV中和モノクローナル抗体のカクテル剤としての治療効果の評価を計画している。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2021

すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 4件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 4件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] Glu333 in rabies virus glycoprotein is involved in virus attenuation through astrocyte infection and interferon responses2021

    • 著者名/発表者名
      Yukari Itakura, Koshiro Tabata, Kohei Morimoto, Naoto Ito, Herman M Chambaro, Ryota Eguchi, Ken-Ichi Otsuguro, William W Hall, Yasuko Orba, Hirofumi Sawa, Michihito Sasaki
    • 雑誌名

      iScience

      巻: 25(4) ページ: 104122

    • DOI

      10.1016/j.isci.2022.104122.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Air-liquid interphase culture confers SARS-CoV-2 susceptibility to A549 alveolar epithelial cells.2021

    • 著者名/発表者名
      Sasaki M, Kishimoto M, Itakura Y, Tabata K, Intaruck K, Uemura K, Toba S,Sanaki T, Sato A, Hall WW, Orba Y, Sawa H.
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 577 ページ: 146-151

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2021.09.015.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] A novel nairovirus associated with acute febrile illness in Hokkaido, Japan.2021

    • 著者名/発表者名
      Kodama F, Yamaguchi H, Park E, Tatemoto K, Sashika M, Nakao R, Terauchi Y, Mizuma K, Orba Y, Kariwa H, Hagiwara K, Okazaki K, Goto A, Komagome R, Miyoshi M, Ito T, Yamano K, Yoshii K, Funaki C, Ishizuka M, Shigeno A, Itakura Y, Bell-Sakyi L, Edagawa S, Nagasaka A, Sakoda Y, Sawa H, Maeda K, Saijo M, Matsuno K.
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 12(1) ページ: 5539

    • DOI

      10.1038/s41467-021-25857-0.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] SARS-CoV-2 Bearing a Mutation at the S1/S2 Cleavage Site Exhibits Attenuated Virulence and Confers Protective Immunity.2021

    • 著者名/発表者名
      Sasaki M, Toba S, Itakura Y, Chambaro HM, Kishimoto M, Tabata K, Intaruck K, Uemura K, Sanaki T, Sato A, Hall WW, Orba Y, Sawa H.
    • 雑誌名

      mBio

      巻: 12(4) ページ: -

    • DOI

      10.1128/mBio.01415-21.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] 細胞内侵入型抗ウイルス中和抗体作出に向けた細胞内移行ペプチドの有用性の検討2021

    • 著者名/発表者名
      板倉友香里、田畑耕史郎、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
    • 学会等名
      第44回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] G蛋白質333位のアミノ酸残基が規定する狂犬病ウイルスの病原性発現機構の解析2021

    • 著者名/発表者名
      板倉友香里、田畑耕史郎、伊藤直人、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
    • 学会等名
      第164回日本獣医学会学術集会
  • [学会発表] 狂犬病ウイルス感染増殖過程におけるESCRT-1構成因子TSG101の役割2021

    • 著者名/発表者名
      板倉友香里、伊藤直人、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
    • 学会等名
      第68回日本ウイルス学会学術集会

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公開日: 2022-12-28  

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