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DNA二重鎖切断（DSB）はDSBはDNA損傷チェックポイント機構によって検知され、その下流でDNA修復や細胞周期の停止を制御する。チェックポイント機構はDNA損傷の構造によって使い分けられており、DSB末端を検出する経路と、一本鎖DNAの露出を検出する経路がある。DSBはいくつかの機構で修復されるが、相同な配列を利用する修復は正確性が高く重要な修復機構である。この反応には、DSB末端を削り込み、一本鎖を露出させる必要がある。チェックポイントはこのようなダイナミックなDNA構造の変化中も損傷を検知し続ける。本研究では、DSB末端を検知するMre11-Rad50-Nbs1（MRN）、一本鎖DNAの露出を検知するRad9-Hus1-Rad1（9-1-1）の2種類の損傷センサー複合体が、DSBに対してそれぞれ独立して重複して機能するという結果を元に、DSB時の損傷応答の解明を目指した。
本年度は、DSBを模したDNAが結合した担体を作成し、これをカエル卵抽出液中（NPE）で反応させてプルダウンを行うことで、基質DNAの状態とDNAに結合したタンパク質を解析できる実験系を構築した。この実験系を用いて二種類の損傷センサーである9-1-1、MRNがそれぞれ単独で働く条件下でのDSB関連因子について経時的な変化を解析した。これら二つの因子がATR活性化因子のリクルートに重複して寄与すること、また、一方の因子のみがDSB末端削り込みヌクレアーゼの呼び込みに働くことを示した。さらに、センサータンパク質以外の因子についてもNPE中から除去して解析を行い、DSB関連因子のDNA結合動体を捉えることができた。今後、このプルダウン系と質量分析などの網羅的な解析を組み合わせることで、様々なタンパク質が働き、多様な反応が起きるDSB時DNA上でのタンパク質の反応ネットワークが明らかになることが期待される。
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