| 研究課題/領域番号 |
21K03798
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
渕脇 雄介 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80468884)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | コロナウイルス / 検査チップ / レーザ改質 |
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| 研究実績の概要 |
新型コロナウイルスなどの感染や疾病をはかる検査デバイスは選択的に反応する生体分子をウェットな環境下で順次反応させるため、煩雑な作業と時間がかかる。これに対してプラスチック表層へのレーザ切断によりタンパク分子の結合が実現できれば、簡便な作業で短時間に医療検査デバイスを生産することが可能になる。これを実証するため本年度は、アクリル基板表面に超短パルス波のレーザ照射を行うことで抗体などのタンパク質が基板に強固に固定化される条件の検討を主に行った。マイクロ流路表面にレーザ照射した部位は微小領域（0.15mm×0.15 mm）なため、抗体液をピエゾ駆動方式のインクジェット印刷によってマイクロスコープでマイクロ流路表面を観察しながら連続塗布(35 pL/shot × 1,000回/秒)することで可能にした。これにより凹構造（深さ0.1 mm）の底面の微小領域に同じ量の抗体タンパクを連続塗布できるようにした。プレ検討としてレーザ改質されたアクリル基板表面には、タンパク質（BSA）などの分子が強固に結合する現象が確認されていることから、単に幾何学的な凹凸構造が改質表面に形成されているだけではなく、親水性の官能基が賦与されていると考えられる。そこでこれを実証するため、新型コロナウイルスの抗体が結合する3種類のリコビナントタンパク（核タンパク、S1タンパク、RBDタンパク）をレーザ改質したアクリル基板表面に固相化することを行った。その結果、IgG抗体液の標準試料をマイクロ流路表面に流して反応させ、続けて結合したIgGと選択的に反応する酵素標識抗体を反応させて基質により発色させたところ、各リコビナントタンパクが基板表面に安定に固相化されていることを確認した。これにより抗原抗体反応を行うタンパク質を乾式下でもスループットに固定化できる基盤技術を構築することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
超短パルス波のレーザ照射条件としてアクリル基板表面のクラッキングが発生することがない最適な焦点距離とスポット径を維持する条件を見つけた。またレーザ照射時に発生するデブリについては、照射後に界面活性剤を含む液中で超音波破砕を10分間行い、その後70 wt%のエタノール溶液で浸漬することにより洗浄除去できることを見出した。フルエンス（J/cm2）とパルス波については、1k Hzのサファイアレーザーで158フェムト秒のパルス波（1.0 mJ/pulse、λ=779nm）を照射したところ、レーザフルエンスとスキャン速度が1.5 J/cm2と0.1 mm/sのときに最も安定してタンパク溶液を固着できることがわかった。インクジェット印刷については、ノズル系が0.035 mmの穴から吐出スピードが1,000 Hzのときに最もまっすぐにタンパク溶液を飛翔・吐出させることができることが分かった。吐出させるタンパク濃度は凡そ0.1mg/mLまでは安定して吐出することができる。また溶液の粘性の影響を殆ど受けないことがわかった。そこで実際に酵素免疫測定法により標準試料の抗体検査を行ったところ、CVが10%以下で15分以内に検出できる結果を得たことから、今年度は順調に研究を推進させた。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画どおり乾式下で作製した検査チップの性能について明らかにするため、ウェットな環境下で生産されている医療検査チップとの差分について調査する。これにより本法で作製された検査チップの有用性とデメリットについての評価を行い必要に応じて改善をはかる。具体的には医学統計的な観点からの検討として検出感度、正確性試験、同時再現性について性能比較を行う。既に公定法として医療現場や検査センターで汎用されている96ウェルマイクロプレートを用いた酵素免疫測定法による結果との比較を行い、本検査チップの分析学的な検出力について確認する。本研究では測定操作の全般を確認するが、乾式下で作製していることから、固相化タンパクの活性低下と、長期保存下での安定性についての検討を行い、本法の生産上の頑健性についても明らかにする。またアクリル製のマイクロ流路基板表面に物理吸着によりタンパクを固相化させた検査チップとの比較を行うことで、本法によるレーザ改質の官能基導入によるタンパク結合の学術的見解についても解を出すことに挑戦する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費についてはインクジェット吐出ノズルとその周辺部材を購入予定であったが、メーカーより部材不足で生産が遅延しているとの連絡があったため次年度以降に購入することとした。また今年度購入予定であった新型コロナ抗体検査キットについては、手元にある血清検体のコロナ株と一致している検査キットが海外から期間中に手に入らなかったため、研究実施計画の順番を入れ替えた。
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