研究課題/領域番号 |
21K04798
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研究機関 | 東京工科大学 |
研究代表者 |
吉田 亘 東京工科大学, 応用生物学部, 准教授 (10599806)
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研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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キーワード | 等温PCR / 修飾塩基 / グアニン四重鎖構造 / i-motif構造 |
研究実績の概要 |
本研究では等温PCRを用いて標的遺伝子中の修飾塩基を簡便に測定する方法を開発することを目的としている。これまでに血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF)プロモーター中に含まれるグアニン四重鎖(G-quadruplex: G4)構造中のCpG配列中のシトシンがメチル化されると、その構造の熱安定性が上昇することを示した。さらに、その領域をポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction: PCR)で増幅させると、メチル化レベル依存的に増幅効率が減少することを明らかにし、PCRを行うだけで簡便にメチル化レベルを測定できることを示した。G4構造形成配列はグアニンが豊富な配列で形成されるため、その相補鎖配列はシトシンが豊富な配列となる。シトシンが豊富な配列ではシトシンとプロトン化したシトシンが形成する塩基(C-C+)が互い違いに折り重なって、intercalated motif (i-motif)構造が形成されることがある。VEGFのG4構造形成配列の相補鎖ではi-motif構造が形成されるが、メチル化がその構造形成に与える影響については不明であった。そこで、メチル化したVEGF i-motif構造の熱安定性を解析した。21-mer VEGF i-motif構造形成配列中には4カ所のCpG配列が含まれるため、それらすべてをメチル化したオリゴヌクレオチドを化学合成し、pH5.0の条件で熱安定性をCDスペクトル測定法により解析した。その結果、メチル化によりVEGF i-motifのTmが5.1℃上昇することが示された。さらに1箇所ずつメチル化したオリゴヌクレオチドを解析した結果、C-C+形成に関与するシトシンをメチル化することによってVEGF i-motifの熱安定性が上昇することが明らかになった。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では等温PCRを用いて標的遺伝子中の修飾塩基を簡便に測定する方法を開発することを目的としている。これまでに、VEGF G4構造がメチル化によって安定化するイオン等の条件を明らかにしたが、その相補鎖配列が形成するi-motif構造がメチル化によって安定化する条件は不明であった。本年度はVEGF i-motif構造形成配列中のCpG配列中のシトシンをメチル化したオリゴヌクレオチドを化学合成し、その熱安定性をCDスペクトル測定法で解析した。その結果、pH4.7から5.9においてメチル化によってVEGF i-motif構造の熱安定性が上昇することが明らかになった。さらに、C-C+塩基対形成に関与するシトシンをメチル化するとその熱安定性が上昇することも明らかになった。今後、これらの知見を基に最適な等温PCRの条件を決定し、標的遺伝子のメチル化レベルを簡便に測定する方法を開発する。
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今後の研究の推進方策 |
本年度に明らかにしたVEGF i-motif構造が安定化する条件を基に、最適な等温PCRの条件を明らかにし、簡便に標的遺伝子のメチル化レベルを測定する方法を開発する。また、これまでにc-kitプロモーター中で形成されるG4構造の熱安定性がメチル化により変化することも明らかにしており、c-kitプロモーターのメチル化レベルも同様に測定できるか検討する。さらに、5-メチルシトシン以外の修飾がG4構造やi-motif構造に与える影響を解析し、これら修飾塩基も同様に測定できる方法を開発する。
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次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症のため予定通りの学会発表ができなかったため、次年度使用額が生じた。なお、令和4年度の直接経費としては物品費728,737円、旅費290,000円、その他110,000円を予定している。
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