| 研究課題/領域番号 |
21K04851
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| 研究機関 | 中央大学 |
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研究代表者 |
津金 麻実子 中央大学, 理工学部, 共同研究員 (00469991)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | リポソーム / エクソソーム / マイクロ流体デバイス |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、人工脂質膜小胞であるジャイアントリポソームを検出反応の容器（リアクター）として用い、エクソソーム内封マイクロRNAを高感度および簡便に検出可能なマイクロデバイスの構築を目的とする。このデバイスは、サンプルに含まれるエクソソームとエクソソーム捕捉磁気ビーズを吸着させて回収する(1)回収エリア、回収エリアから夾雑物の混入を最小限にしてエクソソーム結合磁気ビーズのみを移送する(2)移送エリア、磁気ビーズに吸着したエクソソームと反応試薬内封リポソームとの融合、リポソーム内でのマイクロRNAの増幅と蛍光検出を行う(3)反応・検出エリアの3つのエリアから構成されている。
1年目である本年度は、(3)反応・検出エリアにおけるデバイスの構造、リポソームの融合とマイクロRNAの増幅・蛍光検出の条件検討を行った。本エリアの構造は、研究代表者が2018～2020年度の基盤研究（C）で開発した、ガラス基板上にシリコン電極とリポソームを保持するPDMS製のマイクロウェル構造を有する電気融合デバイスを応用した。エクソソームを模擬したマイクロRNA内封リポソームとマイクロRNA増幅試薬内封リポソームを、リン脂質を用いて界面通過法により作製した。この2種類のリポソームを電気融合デバイスのマイクロウェル部分にトラップさせ、顕微鏡観察下で電圧を印加してリポソームの膜融合を行い、さらにこのデバイス上でリポソームを加温して、マイクロRNAの増幅を進行させ、増幅産物の蛍光検出に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、本研究課題が目指すデバイスの最重要部分である、エクソソーム模擬リポソームからリアクターとしてのリポソームへの膜小胞の電気融合を利用したマイクロRNAの移行と、特定のマイクロRNAの増幅と検出という一連の操作を顕微鏡観察下の1デバイス上で行えるシステムを開発した。マイクロRNAの検出は、プライマー、DNAポリメラーゼ、制限酵素を用いて、標的マイクロRNA配列をトリガーとして増幅し、その増幅産物を蛍光プローブで検出する方法を用いた。リポソームの脂質組成やリポソームを懸濁する溶液の組成を検討することにより、マイクロRNA内封リポソームとマイクロRNA増幅試薬内封リポソームがデバイス内で電気融合し、融合リポソーム内でマイクロRNAの増幅を示す蛍光強度の変化を観察することができた。また、リポソームをトラップするマイクロウェルのサイズ、電圧の導通に関わるウェルの連結部分の構造、加温による溶液の蒸発を防ぐ構造などの工夫によりデバイスの(3)反応・検出エリアの構造を確立させたことから、研究はおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、今年度にマイクロRNAを内封したエクソソーム模擬リポソームで行った実験をヒト由来のエクソソームの標準品を用いて実施し、同様に電気融合、マイクロRNAの増幅反応によって標的マイクロRNAが検出可能か検討する。
さらに、デバイスの(1)回収エリア、(2)移送エリアについても開発に着手する。
(1)回収エリアでは本研究室で開発中のマイクロ混合デバイスを利用する。この技術では、マイクロピラー（微小な柱）を有する基板に微小旋回振動を与えてピラー周囲に振動誘起流を生じさせることにより、微量な溶液の混合が可能である。これまでに、アビジン、ビオチンが結合した大きさが異なる2種類のビーズをモデルとして用い、マイクロピラー構造を有するデバイスにおける振動誘起流による混合で、小ビーズの大ビーズへの結合が大幅に向上する結果を得ている。今後は、ホスファチジルセリン結合分子を固相化した磁気ビーズとエクソソーム標準品を用いて、マイクロピラーのサイズや形状、振動周波数などの条件検討を行い、エクソソームのビーズへの結合効率が高い条件を見出す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
経費は当初の予定通り物品費や学会参加費に使用したが約3万円という少額の次年度使用額が生じた。次年度には同様に物品費として使用する計画である。
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