| 研究課題/領域番号 |
21K05113
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
渡辺 茂 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (70253333)
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| 研究分担者 |
内山 淳平 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (20574619)
仁子 陽輔 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 助教 (20782056)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 蛍光性ナノエマルション / バクテリオファージ / 蛍光顕微鏡法 / 細菌検出 / 高輝度 / 天敵ウイルス / 蛍光プローブ |
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| 研究実績の概要 |
感染症を取り巻く環境は，細菌性食中毒の集団感染，院内感染の多発や新興・再興感染症の発生など多様化しており，早期診断・治療および二次感染の予防には迅速な微生物検査が不可欠である．宿主細菌に対して特異的に感染するバクテリオファージ（“天敵ウイルス”）を機能性ナノ粒子とハイブリッド化することでPCR法や免疫検出法に代わる新たな細菌検出技術への応用が期待できる．高感度かつ高選択的な細菌検出法の開発には，検体中，検出したい細菌にのみ結合し，その情報を我々が検出可能な物理信号に変換する蛍光プローブの開発が不可欠である．本年度は，ファージと蛍光性ナノエマルションを利用した細菌の蛍光検出法の開発について検討した．
蛍光法を利用した高感度・高信頼性の細菌検出には，光安定性に優れ強力な蛍光を発する信号発信部位を有する蛍光プローブが求められる．これまでにファージの頭部に蛍光色素を結合させた蛍光プローブが開発されているが，輝度が低い上に光安定性にも欠ける．そこでオイルと界面活性剤からなる粒径が数十nmのナノエマルションに大量の蛍光色素を溶解させることで，光安定性に優れ高輝度な蛍光性ナノエマルションを開発した．
次に表面にカルボキシル基を導入した蛍光性ナノエマルションを合成し，活性エステルへと導いた後，ファージとアミド結合を介して結合させることで蛍光性ナノエマルション修飾ファージを合成した．これを各種細菌と混合後，蛍光顕微鏡を用いて観察した．試料中の細菌がファージの宿主細菌（S.aureus）である場合，細菌から強力な蛍光が観察されたのに対して，宿主以外の細菌（E.coliなど）からは蛍光が観察されることがなく，蛍光性ナノエマルション修飾ファージを利用して，選択的に細菌を蛍光検出できることがわかった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナウイルス感染症の拡大防止対策により，2021年度に研究活動が制限され，当初計画通りに実験を実施できなかったことが尾を引いて入り，まだ遅れを完全に取り戻せていない．
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では，ファージを多種多様な細菌を識別する“天敵ウイルス素子”と見なし，その優れた宿主認識機能を失わせることなく，機能性ナノ粒子と組み合わせることによって新たな細菌検出技術の開発をめざしており，3つの到達目標を掲げている．
【研究目標1】ファージ機能制御技術の開発：ファージは，細菌に感染し菌体を溶かして増殖するウイルスであり，ファージのライフサイクル（吸着，侵入，生合成，成熟，放出）のうち，吸着機能のみ発揮させる方法について検討する．
【研究目標2】高感度な細菌検出を指向した機能性ナノ粒子の創製：優れた光学特性と磁気特性の両方を兼ね備えた磁性－プラズモンハイブリッドナノ粒子や半導体ナノ粒子をも凌駕する高輝度蛍光性ナノエマルションを設計・合成する．
【研究目標3】ファージと機能性ナノ粒子を利用した新奇な細菌検出原理の実証：ファージの優れた細菌特異性とプラズモンナノ粒子の強力な光散乱特性や蛍光性ナノエマルションの高い発光特性を利用した新たな高感度・高選択的な細菌検出原理を提案・実証する．
本年度は，高輝度蛍光性ナノエマルションおよびファージとハイブリッド化した蛍光性ナノエマルション修飾ファージを開発し，細菌検出の原理実証と定性分析に成功した．次年度は，蛍光性ナノエマルション修飾ファージ利用した高感度・高選択的な細菌の定量分析について検討する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）2021年度は，新型コロナウイルス感染症の拡大防止対策により研究活動が制限されるなど，当初予定していた実験計画の一部を実施できなかったこともあり，試薬等の消耗品費が当初予定額を大きく下回った．また，出席を予定していた学会が，すべてオンライン開催となり，研究成果発表旅費を支出する必要がなくなった．2022年度も年度初めに影響が残っていたこともあり，前年度繰越分まですべて使用するに至らなかった．
（使用計画）2022年度に実施できなかった実験計画を実行し，プラズモニクスナノ粒子をはじめ蛍光性ナノエマルションのような機能性ナノ粒子を作製する無機合成試薬や有機合成試薬の購入など消耗品費として利用することを計画している．
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