| 研究課題/領域番号 |
21K05271
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
有安 真也 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (50586998)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | シトクロムP450 / 擬似基質 / 末端水酸化 / 非天然基質 |
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| 研究実績の概要 |
本計画では、シトクロムP450に擬似基質を添加して、化学的に反応性の低い末端の1級炭素に選択的に水酸基を導入する技術の創製を目指して研究を行っている。昨年度の検討により、これまで擬似基質を用いた反応システムで最も研究が行われてきた巨大菌由来の長鎖脂肪酸水酸化酵素P450BM3や、その類縁酵素（CYP102シリーズ）では、いずれの擬似基質でもプロパン水酸化において、目的とする末端1級炭素の水酸化率は10%以下であったのに対し、自然界で長鎖脂肪酸の末端を水酸化しているCYP153の一種CYP153A33を用いたところ約80%の選択率で末端1級炭素水酸化が可能であることを明らかにした。
本成果を受けて、2022年度は、申請計画通り、CYP153A33に適した擬似基質の探索を行った。これまでにP450BM3用に開発した200種類ほどの擬似基質のうち、末端がフッ素分子で修飾されているデコイ分子、約30種類をCYP153A33に添加し、申請者が開発した微小高圧反応装置を用いたプロパン水酸化を検討した。その結果、いずれのデコイ分子においても、目的とした末端1級炭素選択的水酸化能を示し、その比率は擬似基質の構造に関わらず、80%前後であった。このことは、本反応における位置選択性が擬似基質よりもCYP153A33が持つ、細長い基質ポケットの形状に依存していることを示している。また、P450BM3においては、フッ素修飾した擬似基質よりも、修飾がない一般的な炭素-水素結合で構成された擬似基質の方が、その合成の容易さ、市販のビルディングブロックの多様さから、構造最適化が行いやすく、フッ素修飾擬似基質よりも高活性を示していることから、CYP153A33においても、非フッ素修飾擬似基質の適用を試みたが、予期に反して、プロパン等の水酸化活性はほとんど示さないことを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本計画では、目的の1級炭素選択的な水酸化をシトクロムP450と擬似基質で達成するために、まず、（1）既存の擬似基質ライブラリーを用い、1級炭素水酸化に適したP450の探索を行い、（2）得られた候補P450に対し、構成アミノ酸を別の物に置換する変異導入を行い、さらに1級炭素水酸化選択性を向上する。また、候補P450に特化した擬似基質を開発することで、更なる選択性向上を目指す。（3）最後に基質認識型擬似基質開発することで、基質の両末端に水酸基を導入する計画となっている。
2022年度（2年目）は計画通り（2）の候補P450 (昨年度見出したCYP153A33)に特化した擬似基質の探索を行った。計画では、候補P450の結晶構造を基に、新規の擬似基質の開発を計画していたが、申請者が保有しているP450BM3用の擬似基質の転用したところ、フッ素修飾擬似基質が、優れたCYP153A33活性化能力を持つことを明らかにし、また、その選択性は目的の末端1級炭素に対して80%前後であり、十分な選択性を有していることから、新規の擬似基質の開発は必要ないと判断した。また、申請計画ではCYP153A33に対する変異導入を計画していたが、野生型のCYP153A33と上記のフッ素修飾擬似基質の組み合わせで十分な触媒回転数と位置選択性を示したこと、また、変異導入によるCYP153A33の熱安定性の低下、大腸菌での発現量の低下の恐れがあったため、変異導入の検討は不必要と判断した。申請計画の（1）～（3）のうち、2年目で(2)の目的を達成したことから、進捗状況は概ね順調と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2年目である2022年度は、目的である1級炭素選択的水酸化に適していると判明したCYP153A33に対して、有効な擬似基質の発見に成功した。そこで、今後の研究の推進方策としては、当初の計画通り、次のステップである基質の複数箇所1級炭素選択的水酸化によるジオール類の合成へと挑戦する予定である。そのためには、申請者がこれまでに別の研究で開発した官能基認識擬似基質の成果と組み合わせ、CYP153A33による複数回の1級炭素選択的水酸化の実現を目指す。官能基認識擬似基質としては、末端に水素結合可能な官能基の導入や、金属イオンとの錯形成を利用して、基質と擬似基質を固定する。これにより、CYP153A33の基質ポケット内に反応対象の基質が滞在する時間を延ばし、複数回の水酸化が促進されると期待している。また、CYP153A33は従来のP450BM3と異なり、酵素反応にはCYP153A33の他に、対応する還元酵素を2種類添加する必要があり、3種類のタンパク質発現・精製プロセスが研究の迅速な進捗を妨げていた。そこで還元酵素と連結した自己完結型のCYP153A33の構築や、CYP153A33を過剰発現させた大腸菌自体を反応容器として使う等で、酵素調製プロセスを簡略化し、酵素活性評価の試行回数を増やし、研究の進捗の加速を図っていく予定である。
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