トランスファーRNA修飾酵素によるタンパク質品質管理機構の解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K05272
• 研究機関: 産業医科大学
• 研究代表者: 坂口 怜子 産業医科大学, 医学部, 講師 (80723197)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 転移RNA / イオンチャネル / タンパク質品質管理

研究実績の概要

タンパク質の合成機構は、すべての生物において共通であり、生命維持の根幹を成すシステムである。必要なときに必要なタンパク質を発現させる仕組みにおいて、そのアミノ酸配列を正確に翻訳することは、タンパク質の品質管理上で一番重要である。そのため、遺伝暗号に従ってリボソーム上にアミノ酸を正しい順番で運ぶトランスファーRNA（tRNA）には、その正確さを担保するための仕組みが備わっている。tRNAが機能を発揮するためには、必要な修飾を受けた上で、各コドンに対応するアミノ酸でアミノアシル化されてリボソームに取り込まれる必要がある。修飾を担う酵素が選択性や反応速度などの点で正しく機能しなくなると、誤ったアミノ酸の取り込みや読み枠のズレなどによりタンパク質の品質が低下し、生体応答に異常をきたす。特に、メッセンジャーRNAとリボソーム上で塩基対を形成して特異的なアミノ酸認識に関わる、tRNAのアンチコドン領域（34～36位）とその周辺の配列の適切な修飾は、アミノ酸を正しい配列で結合させていく上で重要である。
tRNAの修飾のうちの一つ、36位グアノシンのメチル化は、ワトソンークリック型の塩基対形成を阻害することで、タンパク質翻訳における読み枠のズレを防止する役割を担う。このメチル化を担う酵素は原核生物(TrmD)と真核生物(Trm5)で異なっており、原核生物のTrmDの欠損は致死性である。そして、原核生物の酵素のみ、その活性に金属イオン要求性がある。
そこで本研究では、この酵素活性に必須の金属イオンの細胞内濃度を制御している機構の解明を目指して、イオンチャネルの変異体の活性評価を行なった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究では、TrmDとTrm5の活性制御機構の解明と両者の違いを明らかにすることを目的とした。具体的には、酵素の活性中心における金属イオン要求性やその上流でイオン濃度を制御する分子実態の探索、その制御が機能しない場合の応答の変化と疾病との関連性の解明を目指している。現在までに、細胞内イオン濃度を制御するイオンチャネルの分子実体の候補として、外界の環境変化を感知してCa2+などを細胞内に流入させる非特異的陽イオン透過チャネルであるTransient Receptor Potential (TRP) チャネルファミリーの機能評価を行なった。TRPファミリーは温度、 pH、レドックス環境、機械刺激など、それぞれが固有の刺激で活性化することが知られている。そして、当研究室では、哺乳類その他で同定されている全28種類のTRPチャネルのクローンを所有している。モデル生物としてHEK293細胞を用いて、患者から同定されてきた様々なTRPチャネル変異体を遺伝子導入により発現させ、細胞内Ca2+濃度の変化を測定した。そのうちいくつかは、細胞内へのCa2+流入量が減少していることを明らかにした。

今後の研究の推進方策

これまでに、HEK293細胞をモデル生物として用いて、患者から同定されたTRPチャネルの様々な変異体を遺伝子導入により発現させ、細胞内Ca2+濃度の変化を測定した。その結果、複数の変異体でCa2+流入能力が低下していることが明らかになった。これらの機能異常が、細胞内金属イオン濃度の恒常性とTrmD酵素活性に与える影響を評価するため、今後、TrmDを大腸菌発現系で発現・精製し、各TRPチャネルとの相互作用の有無をpull-downアッセイで試験する。同時に、各TRPチャネルを発現させた細胞におけるTrmDの発現量をウェスタンブロッティングで評価する。さらに、tRNAを抽出して36位グアノシンのメチル化修飾の効率を定量する。次に、何も発現させていない状態の細胞と比較して変化が見られたチャネルに対して、各種阻害剤や遺伝子ノックダウン法と組み合わせて、活性に必須な金属イオンの制御機構を同定することを予定している。

次年度使用額が生じた理由

研究遂行に必要な細胞培養皿・試薬類の購入にあたり、所属している研究室で進行している他の研究課題で使用する分と共に一括購入したため単価が下がり、当初予定していた予算より安い価格で購入する事が出来た。一方で、予定していた一部の会議や研究会を感染症対策のためにオンラインに切り替えたので旅費を使用しなかった。また、大学独自の別の研究助成を受給する事が出来たので、一部の物品をそちらの予算で購入した。その結果、予算の余剰が生じた。
余剰予算は、細胞内遺伝子導入剤で当初予定していたものより高価だがより効率の良い試薬や、タンパク質検出に用いるより感度の良い抗体の購入に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Cell-autonomous control of intracellular temperature by unsaturation of phospholipid acyl chains (2022)
  • 著者名/発表者名: Murakami Akira、Nagao Kohjiro、Sakaguchi Reiko、Kida Keisuke、Hara Yuji、Mori Yasuo、Okabe Kohki、Harada Yoshie、Umeda Masato
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 38 ページ: 110487～110487
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.110487
  • 査読あり
• [雑誌論文] Osteoclasts adapt to physioxia perturbation through DNA demethylation (2021)
  • 著者名/発表者名: K Nishikawa, S Seno, T Yoshihara, A Narazaki, Y Sugiura, R Shimizu, J Kikuta, R Sakaguchi, N Suzuki, N Takeda, H Semba, M Yamamoto, D Okuzaki, D Motooka, Y Kobayashi, M Suematsu, H Koseki, H Matsuda, M Yamamoto, S Tobita, Y Mori, M Ishii
  • 雑誌名: EMBO reports 巻: 22 ページ: e53035
  • DOI: 10.15252/embr.202153035
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B promotes Ca2+ mobilization and the inflammatory activity of dendritic cells (2021)
  • 著者名/発表者名: L Marongiu, F Mingozzi, C Cigni, R Marzi, M Di Gioia, M Garre, D Parazzoli, L Sironi, M Collini, R Sakaguchi, T Morii, M Crosti, M Moro, S Schurmans, T Catelani, R Rotem, M Colombo, S Shears, D Prosperi, I Zanoni, F Granucci
  • 雑誌名: Science Signaling 巻: 14 ページ: eaaw2120
  • DOI: 10.1126/scisignal.aaz2120
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Functionally deficient TRPV6 variants contribute to hereditary and familial chronic pancreatitis (2021)
  • 著者名/発表者名: Hamada S, Masson E, Chen JM, Sakaguchi R, Rebours V, Buscail L, Matsumoto R, Tanaka Y, Kikuta K, Kataoka F, Sasaki A, Le Rhun M, Audin H, Lachaux A, Caumont B, Lorenzo D, Billiemaz K, Besnard R, Koch S, Lamireau T, De Koninck X; GREPAN Study Group, Genin E, Cooper DN, Mori Y, Masamune A, Ferec C
  • 雑誌名: Human Mutation 巻: 43 ページ: 228～239
  • DOI: 10.1002/humu.24315
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 新規選択的TRPC3/6チャネルブロッカーによるラットPAN-誘導性腎症の緩和 (2022)
  • 著者名/発表者名: 坂口 怜子、岡田 亮、松田 由宗、木稲 真利慧、永田 龍、森 誠之
  • 学会等名: 第99回 日本生理学会大会
• [学会発表] Visualization and Understanding of Subcellular Thermodynamics using Fluorescent Protein-based Thermosensors (2021)
  • 著者名/発表者名: 坂口 怜子
  • 学会等名: 第59回 生物物理学会年会
  • 招待講演
• [産業財産権] 腎臓疾患の予防および／または治療用医薬組成物 (2022)
  • 発明者名: 永田龍,猪阪善隆,山本毅士,余西洋明,森誠之,坂口怜子,岡田亮
  • 権利者名: 永田龍,猪阪善隆,山本毅士,余西洋明,森誠之,坂口怜子,岡田亮
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2022-029773